本发明专利技术公开了一种花椒原生质体培养再生植株的方法，将来源于花椒无菌试管苗叶片的原生质体悬浮于原生质体培养基中，调整密度后经液体浅层静置培养形成细胞团和小愈伤组织；愈伤组织经增殖培养后，接种到分化培养基上培养分化出不定芽，再转接到生根培养基上培养形成完整植株。本发明专利技术对花椒原生质体培养过程中的重要环节进行了深入的研究，尤其是摸索出了专用的原生质体培养基，大大提高了原生质体的细胞分裂频率以及细胞团形成频率。本发明专利技术成功获得了原生质体再生植株，初步建立了完整的花椒原生质体再生体系，对开展花椒体细胞杂交育种、原生质体遗传转化等相关生物技术研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种花椒原生质体培养再生植株的方法及专用原生质体培养基
本专利技术涉及一种花椒原生质体培养再生植株的方法及专用原生质体培养基，属于植物组织培养
技术介绍
花椒（ZanthoxylunmbungeanumMaxim.）又名秦椒、蜀椒、蔓椒，是芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）植物，分布于亚洲、美洲、非洲以及大洋洲的热带和亚热带地区，在全球约有250种，我国有39种14变种，属多年生落叶灌木或小乔木。花椒是我国的原生植物，具有悠久的栽培历史，分布十分广泛，除东北、内蒙古、西藏、新疆等少数地区外，其他省区均有栽植，为我国重要的经济树种。花椒最主要的用途是作为香辛料，多用于食品的烹巧加工调味，具有赋香、增加食欲、掩盖异味以及防腐等作用。花椒还有独特的药用价值。花椒性味辛、热，小毒，《中国药典》记载花椒具有温中止痛，杀虫止痒的功效，用于治疗脘腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹，蛔虫症，湿疹瘙痒等。花椒中活性成分丰富，主要包括挥发油、麻味成分物质、生物碱、黄酮类物质，具有抑菌，抗炎，提高免疫力等作用。花椒还具有早实、速生、耐干旱、易栽培、适应性强、好管理等特点，花椒根系非常发达，固土能力强，因此可作为绿化和水土保持作用的生态树种。我国具有丰富的花椒种质资源，栽培面积和产量均居世界第一，但在花椒育种研究方面比较滞后，且仍有一部分资源处于野生或散生状态。随着花椒种植规模的扩大和花椒产业的发展，传统的花椒品种已不能满足当前发展的需要。植物育种常见的方法有选择育种、杂交育种、诱变育种、倍性育种以及基于生物技术的细胞工程育种与分子育种等。花椒为单性结实，属于无融合生殖，不易进行杂交育种，因此花椒的育种工作集中在选择育种方面，缺点是遗传改良主要依靠自然变异，变异率低，新材料选育的时间太长，育种效果不佳，所以花椒种质创新和良种繁育工作一直没有取得突破性进展。植物原生质体是植物细胞去掉细胞壁后得到的裸露的、具有生命活性的细胞。它可以通过连续的细胞分裂再生成完整植株，即具有细胞全能性；能够摄入如DNA、质粒、病毒、细菌、细胞器等外源物质，是植物遗传转化的良好材料；还可以通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，为实现远缘杂交及克服有性杂交不亲和障碍，及培育植物新品种提供了可能。因此，原生质体培养在植物快速繁殖、植物远缘遗传重组、转基因以及品种改良和创造新类型等方面具有广阔的应用前景，也为花椒育种开辟了新途径。分离获得大量有活力的原生质体是原生质体培养的前提之一。目前，分离原生质体的常规方法是酶解法。分离原生质体适宜材料的选择是原生质体培养成功的基础和关键。叶片、子叶、愈伤组织、胚性细胞悬浮物等均可作为原生质体分离的起始材料，不同的材料各有利弊，并因植物种类而异有所不同。在植物原生质体成功分离过以后，所得的原生质体中常常混杂有细胞团、细胞碎片、细胞器等，需要将原生质体与其他杂质、酶液分开并进行纯化，纯化方法主要有离心沉淀法、漂浮法、界面法等，其原理都是利用原生质体和杂质比重不同而进行分层。植物原生质体培养是将分离纯化后的原生质体转移到适当条件下，按既定方向进行培养。影响原生质体培养的主要因素包括植物基因型、原生质体培养密度、渗透压稳定剂、培养基类型、激素、培养方式等，从原生质体到植株再生，要经历原生质体分裂、愈伤组织生长和植物再生等阶段。原生质体培养在不同的阶段所需培养基不同，一般要求更换几次培养基，即促进原生质体恢复细胞壁、启动分裂并维持细胞分裂的培养基，促进愈伤组织产生生长的培养基和诱导各器官分化的培养基，其中初始培养基直接关系到原生质体能否再生细胞壁，重新启动有丝分裂，进而影响到最后是否能够成功再生植株。目前关于花椒原生质体方面的研究报道很少。在已有的花椒原生质体分离与培养研究中，原生质体的分离纯化已经取得了较好的试验结果，但原生质体的培养方面还存在着细胞分裂频率低、形成细胞团频率低、培养工作效率低等问题，并且还没有人通过花椒原生质体培养获得再生植株，因此急需我们进一步研究，填补这方面的空白。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种花椒原生质体培养再生植株的方法及专用原生质体培养基。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种花椒专用原生质体培养基，其特征在于，由以下成分组成：K2SO4650~750mg/L，NH4NO3180~220mg/L，Ca(NO3)2·4H2O415~455mg/L，CaCl2·2H2O150~190mg/L，MgSO4·7H2O320~360mg/L，KH2PO4160~200mg/L，Fe-EDDHA28.3~28.7mg/L，MnSO4·4H2O17.6~18.0mg/L，ZnSO4·7H2O8.1~8.5mg/L，H3BO33.3~3.7mg/L，KI0.79~0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O0.23~0.27mg/L，CoCl2·6H2O0.02~0.03mg/L，CuSO4·5H2O0.02~0.03mg/L，盐酸硫胺素0.8~1.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.2mg/L，烟酸0.8~1.2mg/L，氯化胆碱0.3~0.5mg/L，生物素0.01~0.03mg/L，抗坏血酸1.6~2.0mg/L，丙酮酸钠20~25mg/L，肌醇100~150mg/L，脯氨酸120~160mg/L，牛血清白蛋白200~250mg/L，鼠李糖50~100mg/L，果糖50~100mg/L，木糖50~100mg/L，核糖50~100mg/L，纤维二糖225~275mg/L，γ-氨基丁酸4.5~5.5mmol/L，毒莠定1.9~2.1mg/L，NAA0.4~0.6mg/L，ZT0.9~1.1mg/L，亚精胺8.0~10.0mg/L，硝普钠90~110μmol/L，呋苯硫脲1.5~1.7mg/L，豌豆浸提液15~25mL/L；渗透压调节剂：蔗糖0.6~0.7mol/L。所述培养基的pH值调整为5.6~6.0。包括以下步骤：1）原生质体培养：将花椒原生质体悬浮于原生质体培养基中，并调整到适宜的密度，用胶头滴管吸取原生质体悬浮液，滴加于培养皿中（直径为3cm），每皿滴加15~20滴左右，形成一液体浅层，用封口膜密封，在25±2℃、黑暗条件下静置培养；培养5~8d后补充一次无渗透压调节剂的原生质体培养基，此后每隔10d补充一次；2）愈伤组织增殖培养：当原生质体培养形成直径1~2mm左右的小愈伤组织时，挑出并接种到愈伤组织增殖培养基（WPM基本培养基+2,4-D1.0mg/L+ZT0.5mg/L+椰子汁20ml/L+蔗糖50g/L+琼脂7g/L）上，在25±2℃、散射光照条件下培养；每隔一段时间，将愈伤组织用解剖刀进行切分，形成较小的组织块，转接到新鲜增殖培养基上进行继代培养；3）愈伤组织分化培养：挑选状态良好的，直径5mm左右的愈伤组织，接种到分化培养基（WPM基本培养基+ZT1.0mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+H2O280μmol/L+本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种花椒专用原生质体培养基，其特征在于，由以下成分组成：K
【技术特征摘要】
1.一种花椒专用原生质体培养基，其特征在于，由以下成分组成：K2SO4650~750mg/L，NH4NO3180~220mg/L，Ca(NO3)2·4H2O415~455mg/L，CaCl2·2H2O150~190mg/L，MgSO4·7H2O320~360mg/L，KH2PO4160~200mg/L，Fe-EDDHA28.3~28.7mg/L，MnSO4·4H2O17.6~18.0mg/L，ZnSO4·7H2O8.1~8.5mg/L，H3BO33.3~3.7mg/L，KI0.79~0.83mg/L，Na2MoO4·2H2O0.23~0.27mg/L，CoCl2·6H2O0.02~0.03mg/L，CuSO4·5H2O0.02~0.03mg/L，盐酸硫胺素0.8~1.2mg/L，盐酸吡哆醇0.8~1.2mg/L，烟酸0.8~1.2mg/L，氯化胆碱0.3~0.5mg/L，生物素0.01~0.03mg/L，抗坏血酸1.6~2.0mg/L，丙酮酸钠20~25mg/L，肌醇100~150mg/L，脯氨酸120~160mg/L，牛血清白蛋白200~250mg/L，鼠李糖50~100mg/L，果糖50~100mg/L，木糖50~100mg/L，核糖50~100mg/L，纤维二糖225~275mg/L，γ-氨基丁酸4.5~5.5mmol/L，毒莠定1.9~2.1mg/L，NAA0.4~0.6mg/L，ZT0.9~1.1mg/L，亚精胺8.0~10.0mg/L，硝普钠90~110μmol/L，呋苯硫脲1.5~1.7mg/L，豌豆浸提液15~25mL/L；渗透压调节剂：蔗糖0.6~0.7mol/L。
2.根据权利要求1所述的一种花椒专用原生质体培养基，其特征在于，所述培养基的pH值调整为5.6~6.0。
3.一种花椒原生质体培养再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）原生质体培养：将花椒原生质体悬浮于原生质体培养基中，并调整到适宜的密度，用胶头滴管吸取原生质体悬浮液，滴加于培养皿中（直径为3cm），每皿滴加15~20滴左右，形成一液体浅层，用封口膜密封，在25±2℃、黑暗条件下静置培养；培养5~8d后补充一次无渗透压调节剂的原生质体培养基，此...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈志盛，
申请(专利权)人：陈志盛，
类型：发明
国别省市：山西;14
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