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唐氏综合征诊断试剂盒制造技术

技术编号:2578293 阅读:491 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
一种唐氏综合征诊断试剂盒,其特征是所述试剂盒包括A、B两个独立的分试剂盒,所述各分试剂盒均由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl↓[2]和等位基因分型标准物混合物构成;A分试剂盒的引物混合物由合装在一起的LFG21、LFG24、LFG26、D21S1409、D21S2052和PentaD六个基因座的长序列引物构成;B分试剂盒的引物混合物由合装在一起的LFG20、LFG29、LFG33、LFG34D21S1435和D21S1436六个基因座的长序列引物构成。采用本发明专利技术的试剂盒尽可能地节约检测时间、样本和耗材。因此,本发明专利技术具有很高的实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可迅速确诊唐氏综合征的试剂盒。唐氏综合征是最先得到公认和最重要的严重染色体疾病之一。英国医生Langdon Down首先对该病进行了描述,故称为Down综合征。1959年, 法国细胞遗传学家Lejeune证实此病的病因是多了 一个小的G组染色体, 后来确定为21号染色体,故也称为21三体。唐氏综合征的临床特征主要 为生长发育迟缓、不同程度的智力低下和包括头面部特征在内的一系列异 常体征,这使得该病在过去又不幸被称为先天愚型。新生儿中,21三体的 发病率约为1/600 - 900,是新生儿中最为常见的染色体异常。95%Down 综合征患者的染色体基础都是继发于减数分裂时染色体不分离所致的21 三体,即全身体细胞均多了一条21号染色体,这类核型称为游离型,通 常临床症状典型而且显著。通过DNA多态性分析,能够在大部分的家庭中 判定不分离发生在双亲中的哪一方以及减数分裂的哪一步。额外的21号 染色体多来自母亲的第一次减数分裂。大约4。/。的Down综合征是非平衡易 位的结果,这种核型为易位型,患者虽然只有46条染色体,但因一条21 号易位到另 一条D组或G组的染色体上,加上正常的两条21号染色体, 仍多了一条额外的21号长臂,而决定本病的关键区带为21号长臂,故临 床上仍表现出21三体的症状。最后,不到3%的Down综合征患者是嵌合 体,同时具有正常的和异常的两种细胞系,症状取决于异常细胞所占的比 例,但一般较轻。目前,除了加强护理和训练,延长患者的寿命,增强其 生活自理能力外,人类对于Down综合征并没有有效的治疗措施。此病的 发生给患者家庭和社会都带来极大的负担。因此,提高产前诊断水平,减 少Down综合征患儿的出生,非常重要。对胎儿细胞进行核型分析是已有的生物非整倍体检测方法,这个过程包括胎儿细胞的体外培养和中期胎儿细胞的核型分析。细胞的体外培养需要一 定数量的存活细胞和相当的专业技术知识,在下列几种情况下都可能无法实施核型分析1、细胞培养失败。据统计,细胞培养失败的发生率约为l一2 %。 2、收集的细胞数目有限,不能得出明确的结论。为确保足够的培养物 用于核型分析,必须获得大于5ml的羊水。当一次羊水穿刺抽出的羊水量少 于5ml时,就不得不进行反复的羊水穿刺,从而增加了感染和损伤的风险。 3、培养物被污染。有文献报道,即使在经验丰富的试验室,母体细胞的污 染率也可达10—14%。 4、由于细胞培养仅限于存活细胞,因此某些特殊的 样本无法进行核型分析,如一些妊娠产物以及福尔马林固定或石蜡包埋样 本。此外,传统的生物非整倍体的检测方法最为显著的缺点是细胞培养过程 耗时太长,大致需要两周左右的时间,这就易于造成处理上的延误。因此, 迅速、准确的检测技术非常有价值。近年来,荧光原位杂交(fluorecent in situ hybridization, FISH) 和定量荧光PCR (quantitative fluorecent polymerase chain reaction, QF-PCR)已经应用于生物非整倍体的检测。就荧光原位杂交检测生物非整倍 体的方法而言,间期细胞的荧光原位杂交可不必进行细胞培养,大大縮短了 诊断所需的时间;商业化探针的应用提高了 FISH的敏感性和特异性。但另 一方面,这项诊断技术仍然具有一定的局限性1、在未培养的羊水中,荧 光标记的探针会与细胞骨架非特异性地结合,使背景不清晰,FISH的有效 性大大降低。2、必须要有完整的细胞用于分析。3、对实验人员的专业技能 要求较高。4、母体细胞的污染会导致对实验结果的错误解释。5、相较QF -PCR, FISH分析耗时长、成本高,限制了其对样本的高通量检测。定量荧光PCR方法利用了基因组中广泛分布的短串联重复序列(short tandem repeats,以下简称STR )。 STR通常由2 ~ 6bp的核心序列串联重复而成,具有高度的多态性,易于采用复合扩增方式进行扩增。而荧光复合扩增 是目前世界上应用最普遍的复合扩增方法,通常是在各个靶序列其中一条引 物的一端标记上荧光物质,.利用自动激光荧光遗传分析仪对产物进行检测。 STR的扩增产物在电泳时按片段大小分离,根据荧光峰的数目和强度确定每 个等位基因的拷贝数,从而反映特定染色体的拷贝数。正常的杂合子个体会产生高度相近的两个峰,纯合子则表现为单独的一个STR峰。由于PCR(聚 合酶链式反应)扩增方法和荧光检测的应用,这种检测方法非常灵敏,可用 于少量样本的检测,如母体血液中收集的胎儿细胞或胎儿DNA,也可确定母 体细胞的污染。尤为重要的是,这种方法非常迅速,DM的提取和扩增仅需5 个小时左右,每个荧光产物的分析会在半小时内完成。加之易于实现自动化, 有可能对36~96个样本同时进行检测,因此几十个,甚至几百个样本的检测 结果可在一天内得到。对于定量荧光PCR检测方法的检测结果的认定目前还 很有争议,因为这种方法本身尚存在一些问题。首先,目前的定量荧光PCR 检测方法仅选取了每条染色体上的2 - 4个STR位点进行复合扩增。对一个特 定的染色体来说,仅由2 - 4个STR位点构成的检测系统通常不能保证检测出 所有的非整倍体,尤其当STR位点的杂合度不髙时。在许多运用定量荧光PCR 检测方法的检测中,总有部分样本不能提供信息,即一条染色体上的几个位 点均表现为一个STR峰,无法分辨是正常还是非整倍体的纯合子。尤为重要 的是,定量荧光PCR检测方法在检测到两个峰时,将峰高或峰面积的比值与 事先建立的正常参考值范围对照,作为判断是否是非整倍体的依据之一,这 使该方法的有效性大大降低。PCR是个复杂的反应过程,扩增产物量和模板 量并不是简单的线性关系,当出现两个等位基因峰时,对结果的判断在实际 操作中比较复杂。若两个峰的高度或面积的比值接近正常参考值范围的界值, 对结果的判断就会模棱两可;多个靶位点的复合扩增,由于荧光峰的重叠, 其位置和强度有时也难以解释;某些位点存在优势扩增现象,很容易导致误 诊,尤其是在模板量少时。当出现优势扩增时,或是由于片段小的等位基因 过度扩增而将染色体的非整倍体误判为正常的二倍体,或是由于正常二倍体 个体的一个等位基因扩增效率低而被误判为非整倍体。在实践中,定量荧光 PCR通常是作为 一种辅助的检测方法而与传统的细胞遗传学方法联合使用, 最后的确诊结果仍需通过细胞遗传学的方法获得。本申请人在中国专利技术专利ZL2004 1 00218224号中曾公开了一种21号染 色体数目异常的快速检测方法。该方法采用荧光复合扩增方式对样本DNA中 的多个21号染色体特异性STR位点进行扩增。复合扩增的产物在DM遗传分 析仪上进行电泳和分析。最后,对等位基因峰的数目进行辩认,当观察到两 个以上的21号染色体特异性STR位点具有三个等位基因峰时,认定该染色体 数目异常,为三体性。利用这种21号染色体数目异常的快速检测方法,开发 唐氏综合征的商品化诊断试剂盒,将促进这种方法在临床实践中的推广应用, 对实现唐氏综合征的快速确诊是非常有意义和实用价值的。
技术实现思路
本专利技术的目的即是提供一个可快速确诊唐氏综合症的试剂盒。 本专利技术的唐氏综合征诊断试剂盒包括A本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种唐氏综合征诊断试剂盒,其特征是所述试剂盒包括A、B两个独立的分试剂盒,所述各分试剂盒均由分离包装的引物混合物、DNA聚合酶、缓冲液、MgCl↓[2]和等位基因分型标准物混合物构成;A分试剂盒的引物混合物由合装在一起的LFG21、LFG24、LFG26、D21S1409、D21S2052和PentaD六个基因座的长序列引物构成,其中,LFG24基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-AGGTTCTAGGAAACATGGCTG-3’SB1-P2:5’-F1-TGTTCTT-TGCAAAACTGCTCTGGACT-3’,LFG26基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-TTAGAGTTGACAAACTCCATGTTG-3’SB2-P2:5’-F2-TGTTCTT-TCTGAGCTAGTTGGGAGGATAG-3’,D21S1409基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-GGAGGGGAATACATTTGTG-3’SB2-P2:5’-F2-TGTTCTT-TTGCCTCTGAATATCCCTAT-3’,LFG21基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-TTGGCGAATCATGACACTAA-3’SB3-P2:5’-F3-TGTTCTT-GGGAAGCCTCAAGGAATAAC-3’,D21S2052基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-GCACCCTTTATACTTGGGTG-3’SB3-P2:5’-F3-TGTTCTT-TAGTACTCTACCATCCATCTATCCC-3’;PentaD基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG-3’SB3-P2:5’-F3-TGTTCTT-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG-3’;B分试剂盒的引物混合物由合装在一起的LFG20、LFG29、LFG33、LFG34D21S1435和D21S1436六个基因座的长序列引物构成,其中,LFG20基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-TGAGGTAGGTTCCTTAGCCC-3’B1-P2:5’-F1-TGTTCTT-AAGGCCTCCCCTATGTTATG-3’,D21S1436基因座的长序列引物:SA-P1:5’-TGTTCTT-AGGAAAGAGAAAGAAAGGAAGG...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:侯一平颜静李英碧吴谨张霁罗海玻叶懿云利兵
申请(专利权)人:四川大学
类型:发明
国别省市:90[中国|成都]

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