丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶体外活性测定方法及应用技术

本发明专利技术丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶体外活性测定方法及应用涉及的是建立丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶（ＮＳ５Ｂ蛋白）活性体外测定的安全、实用的方法、应用涉及基因工程技术、纳米磁分离富集和ＲＮＡ相关技术领域。本发明专利技术利用基因工程技术表达纯化可溶性的ＮＳ５Ｂ蛋白，并制备磁性纳米颗粒。将ＲＮＡ模板一端固定在磁性纳米颗粒上，加入９６孔反应板微孔内，再加入ＮＳ５Ｂ蛋白等构成ＲＮＡ复制体系，在磁性纳米颗粒上复制的ＲＮＡ双链，掺入标记了生物素。ＲＮＡ复制后，用外磁场磁铁将磁性纳米颗粒吸附在微孔底部，反复洗涤吸附后与辣根过氧化物酶标记的亲和素结合，吸附洗涤后，加入辣根过氧化物酶的底物显色。利用建立的方法，可从中药库及化合物库内筛选新的ＮＳ５Ｂ蛋白酶活性抑制剂。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ酶聚合酶活性测定的方法，其特征在于：（１）．ＮＳ５Ｂ片段的ＰＣＲ扩增：利用ＰＣＲ技术扩增Ｃ端截短２１个氨基酸的ＨＣＶＮＳ５Ｂ基因片断；（２）．表达ＨＣＶＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白片段重组质粒的构建：提取质粒ｐＥＴ２８ａ（＋），用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，同样用ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ双酶切ＰＣＲ扩增的ＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内；取等摩尔浓度的上述两种酶切后ＤＮＡ片段，在同一离心管内用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，使ＮＳ５Ｂ蛋白基因片段插入到载体ｐＥＴ２８ａ（＋）内的ＢａｍＨＩ和ＸｈｏＩ位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白；（３）．重组质粒和表达融合蛋白工程菌的筛选与鉴定：将重组质粒转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布含卡那霉素浓度为６０μｇ／ｍｌ的ＬＢ平板，置３７℃过夜；次日随机挑取转化菌落和一个对照菌，对照菌为质粒ｐＥＴ２８ａ转化菌，诱导表达的目的蛋白，收集菌体进行十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，重组子表达相对分子量约为６５ｋＤ的ＨＣＶＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白，而对照菌ＢＬ２１（ＤＥ３）无此蛋白带；将筛选出的阳性克隆表达菌提取质粒进行ＰＣＲ扩增鉴定和酶切鉴定，鉴定正确的质粒进行测序，测序结果完全正确；（４）．表达的ＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白的纯化：１）表达ＮＳ５Ｂ蛋白工程菌的超声裂解将诱导表达融合蛋白的工程菌离心收菌，菌体重悬于裂解液内，冰浴超声破菌，离心收集上清，弃沉淀，收集的上清液用于下一步的亲和纯化；２）镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化将镍琼脂糖凝胶亲和层析柱连接至常压层析系统，先用平衡液冲洗平衡，细菌超声裂解上清液加镍琼脂糖凝胶凝胶室温结合，上柱后收集穿过峰。用结合缓冲液洗涤柱子，接着用分别含１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白；（５）．纯化的ＮＳ５Ｂ蛋白用作抗原检测ＨＣＶ抗体：将纯化的ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白用５０ｍｍｏｌ／Ｌ的碳酸盐ｐＨ９．６倍比稀释后包被酶联板，间接酶联免疫法检测已知的抗丙肝病人阳性血清及正常人血清，ＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白能与丙肝病人阳性血清反应，不与正常人血清反应，说明ＮＳ５Ｂ－Ｃ２１蛋白有较好抗原性和特异性；（６）．磁性纳米复合颗粒修饰首先，液相载体可采用磁性纳米颗粒，将之加入乙醇／水的比例为...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，杨华凤，潘明洁，吕敏，戚菁，王正茂，
申请(专利权)人：李越希，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]