无机磷诊断/测定试剂盒及无机磷浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）诊断／测定试剂盒，同时本发明专利技术还涉及测定无机磷浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇２－脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度下降的程度／速度，从而测算出无机磷的浓度大小。采用本发明专利技术完全可以通过紫外／可见光分析仪器得出所需的测定结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，同时本专利技术 还涉及测定无机磷浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领 域。
技术介绍
人体内磷的87%都存在于骨骼中，血液中的磷和骨骼中的磷保持动 态平衡，血中钙、磷浓度之间有一定关系，正常人血钙升高则血磷降 低，反之亦然。血浆中、浓度的乘积保持在一定范围；大约每 100毫升血浆钙磷浓度的乘积为35——40。当二者乘积大于40时，钙 和磷以骨盐形式沉积在骨组织，>70时，可发生转移性钙化。当乘积 <35时，则将妨碍骨组织的钙化，甚至使骨盐再溶解，影响成骨作用， 引起佝偻病或软骨病。血浆、 的恒定，主要受维生素D，甲状 旁腺激素及降钙素的调节。由于人体的磷目前还不能直接测定，所以无机磷的检测实际上是分 析磷酸盐阴离子(H2P04"， HPO,)。常用的方法有磷钼酸还原法，非 还原法，染料结合法，酶法，同位素稀释质谱法、原子吸收分光光度 法和流动注射分析法等。决定性方法是同位素稀释质谱法，WHO推荐 的中等实验室测定无机磷的常规方法是比色法。磷钼酸还原法又有无蛋白学滤液法和不去蛋白法，后者需在试剂中加入非离子型表面活性剂以避免混浊。所用还原剂和表面活性剂种类 很多，性能比较稳定的还原剂有硫酸亚铁，硫酸亚铁铵，硫酸肼，米吐尔等。表面活性剂则以聚乙二醇基苯基醚(TritonX-100)最理想。 磷钼酸非还原法(直接紫外法)在340nm或325nm直接测定磷钼酸杂 聚化合物，方法简便，便于自动化。但黄疸，溶血，脂浊血清在340nm 有光吸收，必须做标本空白，否则结果偏高。酶法测定无机磷是发展趋势，其优点是无机磷酸盐化合物在酶作用 下的中性范围内是稳定的，可用于常规样品的自动化分析。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测 还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得 以测定无机磷浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的 无机磷(磷酸根)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见 光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行无机磷浓度测定，而且测定 速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术无机磷浓度测定方法原理如下磷酸根+蔗糖蔗糖磷酸化酶果糖+葡萄糖-1-磷酸 果糖+还原型辅酶甘露醇2-脱氢酶甘露醇+辅酶这种方法应用蔗糖磷酸化酶(Disaccharide phosphorylases ; EC 2.4.1.7)酶(偶)联甘露醇2-脱氢酶(Mannitol dehydrogenase ; EC 1.1.1.13S ; EC1.1.1.67)酶促反应连续监测法/终点比色法。蔗糖磷酸化酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过(偶)联合甘露醇2-脱氢酶的作 用，最终将还原型辅酶(在340nrn处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm 处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的 程度/速度，通过测量340mn处吸光度下降的程度/速度，可以测算无 机磷的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术无机磷诊断/测定试剂盒较为理想-缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖 30 mmol/L蔗糖磷酸化酶 12000 U/L甘露醇2-脱氢酶 16000 U/L本专利技术的无机磷诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇 2-脱氢酶。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂l缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、蔗糖。试剂2缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶。还原型辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶在试剂1或试 剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。试剂2缓冲液、稳定剂、蔗糖。试剂3缓冲液、稳定剂、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶。还原型辅酶、蔗糖、蔗糖磷酸化酶、甘露醇2-脱氢酶在试剂l、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定无机磷浓度的方法，其还 原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的 一种。具体实施例方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的无机磷诊断/测定试剂为单试剂，包括三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L 还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖 30 mmol/L 磷酸化酶 1200 mmol/L甘露醇2-脱氢酶16000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机 磷样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延 迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出无机磷 的浓度大小。 实施例二本实施例的无机磷诊断/测定试剂为双试剂，包括:试剂1三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂 50 mmol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L蔗糖 20 mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L稳定剂蔗糖磷酸化酶 甘露醇2-脱氢酶50 mmol/L 2000 U/L 24000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测无机 磷样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下 降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出无机磷 的浓度大小。 实施例三本实施例的无机磷诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L稳定剂 还原型辅酶 试剂2三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液50 mmol/L 0.25 mmol/L10Ommol/L50 mmol/L试剂3三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L蔗糖磷酸化酶 24000 U/L甘露醇2-脱氢酶 36000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定无机磷浓度时，在全自动生化分析仪上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用酶比色法及酶联法技术的无机磷（磷酸根）浓度测定方法，其方法原理如下：磷酸根＋蔗糖蔗糖磷酸化酶果糖＋葡萄糖－１－磷酸果糖＋还原型辅酶甘露醇２－脱氢酶甘露醇＋辅酶将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度下降的程度／速度，测算出无机磷的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]