本发明专利技术涉及起源于可变剪接机制的新型可溶形式的ＥＰＣＲ，并且更具体而言，涉及包括序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的残基２０１－２５６或所述序列的片段的多肽。本发明专利技术还涉及包括所述多肽的重组或分离的ＥＰＣＲ蛋白质，编码所述多肽的分离的多核苷酸，编码包括所述多肽的蛋白质的ｍＲＮＡ，及其在疾病检测中的用途。本发明专利技术进一步涉及包括所述多核苷酸的表达载体或宿主细胞，包括表达载体和所述细胞的表达系统，对于所述多肽特异的分离抗体，以及用于体外选择性检测生物学样品中包括序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的ＥＰＣＲ蛋白质的方法和试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非蛋白水解起源的新型可溶性EPCR蛋白质及其用途
技术介绍
所述C蛋白系统(PC)的最后蛋白是内皮C蛋白/激活C蛋白受 体(EPCR) (1,2)。 EPCR表达在内皮细胞膜上并以高亲和力(Kd~ 30nM)结合PC和激活C蛋白(APC)。它的生理学使命是使PC集中在内皮表面上并将其呈递给凝血酶-血栓调节蛋白复合物，从而促进 PC的有效激活(3)。在对非人灵长类进行的研究中，已证实用单克 隆抗体阻断EPCR使APC的生理学生产减少90%，并且近期研究提 出EPCR的遗传缺陷可能易于罹患静脉和动脉血栓形成(4-7)。这些 事实证实EPCR可能在凝固调节和血栓形成中起重要作用。此外， EPCR似乎是负责PC的有效抗炎作用的分子之一。PC/APC与EPCR的相互作用可能在由革兰氏阴性菌感染的过程 中发展的凝血病和炎症应答调节中起关键作用(8)。近来，已证实 APC对内皮细胞具有抗炎和抗细胞凋亡作用，并且EPCR的存在是这 种作用变得明显所必需的(9， 10)。EPCR是大约46 kDa的糖蛋白。成熟蛋白在除去信号肽后包括221 个氨基酸，所述信号肽由17个残基组成(11)。它由位于染色体20 的长臂(20qll.2)中的基因编码，由3个内含子打断的4个外显子形 成(12)。外显子I编码5'非翻译区和信号肽，外显子IV编码跨膜 结构域、3个残基的胞质内尾以及3'非翻译区。外显子ii和m编码 EPCR的大部分胞外区，其与属于I类主要组织相容性复合物的CD1 超家族的蛋白质的结构域ocl和a2具有同源性。近来，显示EPCR如何具有由折叠的P折叠形成的平台的三维结构已设法被结晶和分析， 在所述平台上2个具有a螺旋构象，其形成稳定分子的其中容纳磷脂 的口袋U3)。同样地，通过丙氨酸扫描，涉及与PC/APC结合的主 要残基已被鉴别，在钙和镁离子的存在下它经由它的GLA结构域与 所述主要残基结合(14)。但是，除了内皮细胞膜上锚定的EPCR之外，还存在血浆可溶形 式(sEPCR)，其至少部分地来自EPCR通过经由刺激物例如;疑血酶 诱导的金属蛋白酶的消化U5， 16)。文章(15 ) J. Clin. Invest.第100巻,no. 2 July 1997, 411-418,涉 及在血浆中发现的可溶形式的EPCR。它说明血浆中的EPCR似乎是 独特的种类，并且纯化蛋白质的氨基末端片段测序给出血浆EPCR的 独特序列，其与重组sEPCR的氨基末端序列一致。它说明在其他受体 的情况下，所述可溶性EPCR的起源可能是蛋白水解破裂，或可变切 割-剪接机制，并且具体地牛EPCR的基因组结构包含可变切割位点， 其编码其中跨膜结构域由内含子编码的序列代替的蛋白质，所述内含子位于外显子III后(17)。这个文件指出将需要更多的研究以证明 来源于可变切割的EPCR形式的可能性。此外，申请WO-9900673涉及人血浆中的sEPCR的分离和表征， 并且它说明sEPCR可能来自蛋白水解，其中EPCR的胞外结构域被释 放并且使蛋白其余部分结合膜，或来自mRNA的可变切割-剪接机制， 这产生altsEPCR的序列。本申请的图l显示图解，其中观察到蛋白水 解起源的可溶性EPCR(psEPCR)、通过可变切割-剪接获得的申请 WO-9900673中公开的EPCR (altsEPCR )、以及本专利技术的新EPCR对 象(sEPCRvar)之间的差异。本申请因此指出至少人EPCR可以经历可变切割-剪接过程，从而 产生可溶性截短的EPCR，其包括只在来源于所述可变切割-剪接机制 的可溶性EPCR ( sEPCRvar)中存在的独特插入片段。所述sEPCRvar 可以充当大血管和癌症中的疾病过程标记。当APC结合sEPCR时，它失去它的抗凝血性但维持它的酶促能 力，由于这个原因认为sEPCR改变APC特异性，可能将其导向目前 未知的底物，其可以连接至归因于APC的抗炎性质(18) 。 sEPCR 与膜上存在的EPCR竟争C蛋白并以这种方式抑制APC产生。还已 描述sEPCR通过蛋白酶-3 (PR3) (19)和Mac-1 (CDllb/CD18)能 够与活化的嗜中性粒细胞相互作用，所述蛋白酶-3是存在于嗜中性粒 细胞颗粒中的蛋白酶，且Mac-1是存在于嗜中性粒细胞和单核细胞表 面上的诱导型表达的整联蛋白。PR3可能涉及作用于膜结合的TNF-a 和IL-l卩前体的组织破坏机制。Mac-l干涉细胞信号传导和胞间粘附现 象，与粘附分子例如内皮ICAM-1相互作用，由于这个原因它在炎症 过程的嗜中性粒细胞募集中起作用。推测起来，sEPCR与PR3和Mac-1 的结合将减少它们的活性。由人基因组DNA (cDNA)开始，本专利技术人已能够克隆并表达新 蛋白质。它的序列与其他已知序列的分析和比较，以及其功能表征已 证实所述蛋白质是通过可变剪接过程产生的未知形式的可溶性EPCR 蛋白质。另一方面，所述蛋白质具有作为鉴别特征的由最初视为EPCR 基因3'非翻译区的区域编码的多肽区，其在目前已知的EPCR形式中 不存在。专利技术描述本专利技术首先涉及新型可溶形式的EPCR，我们称其为可溶性EPCR 变体(sEPCRvar)，更具体而言涉及来源于内皮C蛋白受体的多肽， 其包括序列SEQ IDNO:l的残基201-256，或所述残基序列的片段。 在具体实施方案中，所述片段具有至少9个氨基酸。根据本专利技术的具 体实施方案，所述片段选自包括SEQ ID NO:l的残基213-227、 229-242、 212-226、 227-241、 242-256的片^殳。特异性抗体^操作中是特別有用的。U;、、" '本专利技术进一步涉及分离或重组蛋白质，其包括由序列SEQ ID NO:l的残基201-256形成的多肽，所述蛋白质是EPCR蛋白质。根据本专利技术的优选实施方案，所述分离或重组EPCR蛋白质包括 序列SEQ ID NO: 1。本专利技术的另外目的是包括由序列SEQ ID NO:l的残基201-256、 或所述残基序列的片段形成的多肽的重组蛋白质。本专利技术的另外目的是包括编码由序列SEQ ID NO:l的残基201-256或所述残基序列的片段形成的多肽的序列的多核苷酸。在具体实 施方案中，所述多核苷酸来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列。这 种cDNA涉及由mRNA逆转录的DNA。在具体实施方案中，本专利技术的多核苷酸可以包含在DNA构建体 中。因此，本专利技术的另外目的是编码包括序列SEQ ID NO:l的残基 201-256,或所述残基序列的片段的蛋白质或多肽的DNA构建体。优 选地，所述片段具有至少9个氨基酸。在所述构建体的具体实施方案 中，它包括来自对应于SEQIDNO:2的cDNA序列的多核苷酸。所述 DN A构建体可以整合可操作地结合所述蛋白质或多肽的控制序列。关于核酸或多核苷酸，"可操作地结合"意指一个核苷酸区域置于与另 一个核苷酸序列的功能关系中。"控制序列"是由某一宿主细胞特异 识别的表达信号，其调节功能，例如某一编码序列的转录和翻译。启 动子、表达增强子、转录终止子、核糖体结合位点等是控制序列。剪接所需序列以形成DNA构建体可以通过在合适的限制位点切割和剪 接来进行。如果这些结本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自内皮Ｃ蛋白受体的多肽，其作为关于主要血管和癌症中的疾病过程的标记有用，其特征在于它包括序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的残基２０１－２５６，或所述２０１和２５６之间的残基序列的片段。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J赫米达桑托斯，R蒙特斯迪阿茨，E莫利纳布伊，E马蒂纳茨安索，
申请(专利权)人：西马生物医学计划公司，
类型：发明
国别省市：ES[西班牙]
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