免疫组质谱检测个体化肿瘤生物标志及疗效试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种通过被抗体组吸附表面基质上捕获的生物标志，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测。免疫组质谱（Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＩＭＳ）检测的定义为一组多种（类）抗体与质谱联合来精确地鉴别变异的或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群。本发明专利技术的方法可用于检测已经脱离人体的体液中的生物标志组合。本发明专利技术特别对评估传统肿瘤标记物阴性的恶性肿瘤及肿瘤治疗疗效监测具有重要意义。这些生物标志组合可以用于同时鉴别正常人及个体化肿瘤病人离体体液的生物标志及监测肿瘤疗效的试剂盒和检测方法。本方法精确、方便且快捷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的生物样品中蛋白质分析方法， 一种通过能与抗体结合的基质去捕 获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测生物标志。在此提及的此项专利技术涉及疾 病检测领域，为一种新的非侵入性的体外检测方法。更确切地讲，此专利技术涉及到生物标志 (biomarkers)，而这些抗原或生物标志能被以更高的特异性和灵敏度的抗体组及定量控 制的质谱将多种疾病一次性区分出来。免疫组质谱技术特别对评估传统肿瘤标记物阴性的 恶性肿瘤及肿瘤治疗疗效监测具有重要意义。本专利技术可以应用到已经脱离人体体液中个体 化肿瘤病人的生物标志及监测肿瘤疗效的检测方法或试剂盒开发。
技术介绍
随着人类基丙组计划的实施和完成，科学家们提出了后基肉组(past-genome)计划的 概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年， 澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念， 指的是"一种基闲组所表达的全部蛋白质"，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部 蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(pr,)teomic、s)。 蛋白质组学被认为是后基闲组研究中最主要的部分。与基冈组相比，蛋白质组的组成更复 杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究， 如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和 调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学 等的重要研究手段。目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中己经得到越来越多的应用。在蛋白质组 学中以下三项技术的进步对于实验诊断与临床医学研究进展将具有决定性的影响。 蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的混合物分离成单一 蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方法可以比较两个蛋 白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳(two-d imensionalgel electrophoresis, 2-DE)、高效液相层析(high-performance liquid chromatography， HPLC )、毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE )、亲和层析(affinity choromatography)、 蛋白芯片(protein microarray)、磁性微球(magnetic beads)禾ff 免疫组等。特别是蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白指纹图谱技术克服了以往技术的缺 点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好(CV < 5 10%)、可机械化操作和方法灵活等 特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织 液等；检测快速， 一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅 约1小时。蛋白芯片和磁性微球两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在肿瘤标志 (tumor marker)检测方面创造革命性突破。生物质谱(biological mass spectrometry)技术生物质谱是化学领域中非常重要的一种分析方法。它通过测定分子质量和相应的离子电荷实现对样品中分子的分析。19世纪末科学家已经奠定了这种方法的基础，1912年科 学家第一次利用它获得对分子的分析结果。在质谱分析领域，已经出现了几项诺贝尔奖成 果，其中包括氢同位素氘的发现(1934年诺贝尔化学奖成果)和碳60的发现(1996年诺贝 尔化学奖成果)。不过，最初科学家只能将它用于分析小分子和中型分子，由于生物大分 子比水这样的小分子大成千上万倍，因而将这种方法应用于生物大分子难度很大。美国科 学家约翰 芬恩与日本科学家田中耕一在传统的质谱分析法基础上专利技术了一种新方法对 生物大分子的质谱分析法。首先将成团的生物大分子拆成单个的生物大分子，并将其电离， 使之悬浮在真空中，然后让它们在电场的作用下运动。不同质量的分子通过指定距离的时 间不同，质量小的分子速度快些，质量大的分子速度慢些，通过测量不同分子通过指定距 离的时间，就可计算出分子的质量。蛋白质组学常用的生物质谱有五种1. 电喷雾电离质谱(electrospray ionizsation mass spectrometry, 1':SI-MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带 电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多 个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离f化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比(mass to charge ratio, m/z)降低 到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实 分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。2 . 基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectroTietry， MALDI-TOF-MS)的基本原 理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射 所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使连同分析物一起进 入气相。MALDI-T0F-MS所产生的质谱图多为单电荷离子，冈而质谱图中的离F与多肽和 蛋白质的质量有一一对应关系。MALDI-TOF-MS与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增 强激光角率吸/电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption /ionization time of fight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)。3. 快原子轰击质谱(fast atom bomebardment mass spectrometry' FABMS)是-一禾中 软电离技术，应用快速惰性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器。 这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特别适用于多肽和蛋白质等的分 析研究。4. 同位素质谱是一种开发和应用比较早的技术，被广泛地应用于各个领域，但它在 医学领域的应用只是近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力，该化合物 又易于用同位素标示，人们就想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含量以达 到检测该病原菌的A的，同时也为同位素质谱在医学领域的应用开辟了一条思路。5. 免疫组质谱(immunomic mass spectrometry, IMS)是质谱与抗体分离技术联合 应用。免疫组质谱检测(immunomic mass'spectrometry ana]ysis, IMSA)的定义为一组. 多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基 质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可 以同时检测多个生物标志群。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用含有抗体组的基质去捕获生物样品中生物标志的分析方法，其特征是采用免疫组质谱法对样品中已被抗体组捕获的生物标志进行精确地鉴别、检测的方法。该方法通过以下步骤实现：　　　　（１）样品处理及质谱标准化质控血清制备；　　　　（２）基质与多种抗体结合试剂盒制备、样品上样；　　　　（３）洗涤；　　　　（４）质谱的定量控制及质谱测试；　　　　其中所述步骤（１）将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用Ｏ型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤（２）将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物的基质中的一个位点上。支持物可用金属片、玻璃片、陶瓷片、陶瓷珠、磁性珠、多聚体、液相色谱柱子或毛细管电泳柱子等。基质是任何能与抗体选择性或特异性结合的物质；所述步骤（３）用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留１０秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用水彻底洗涤整个阵列点，自然干燥基质及滞留的生物标志；或用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点（当用陶瓷珠、磁性珠、多聚体、液相色谱柱子或毛细管电泳柱子为支持物时），将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所述步骤（４）加０．５μＬ吸能分子（以５０％乙腈，０．５％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液）用质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去分析。用计算机分析数据。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许洋，
申请(专利权)人：许洋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]