用于单细胞组学的方法技术

用于单细胞组学的方法涉及一种对单细胞内容物进行双向平面电泳，并应用ＡＦＭ或高灵敏ＣＣＤ进行检测的方法。该方法的核心是将单个细胞的内容物在固体／液体界面或薄层凝胶中进行双向电泳，然后应用原子力显微镜或高灵敏ＣＣＤ进行检测鉴定，最后将分离与检测结果制成数据库。本发明专利技术设备简单、操作便利，能对单细胞级别的微量样品进行分离，并对分离产物进行单分子级别检测，可用于蛋白质组学、代谢组学及细胞生物学等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，对单细胞内容物进行双向平面电泳，并应用AFM或高灵敏CCD进行检测的方法，属于蛋白质组学及细胞生物学等领域。
技术介绍
如今，人类基因组计划(Human Genome Project)已经取得了巨大的成功，许多物种的基因组测序都已完成，但仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象还远远不够。因此， 研究的重心从揭示分子水平的遗传信息转移到了细胞水平的功能与调控上来。生命科学已经跨入了后基因组时代，即蛋白质组时代。蛋白质组(proteome)是指一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质。蛋白质组学(proteomics)是指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与疾病的关系。蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质奠定基础。二维凝胶电泳(2-dimension electrophoresis)-质谱(mass spectrometry)是目前石if究蛋白质组学最流行和可靠的技术平台。其一般过程是细胞或组织培养，样品制备，二维凝胶电泳分离蛋白质，染色，计算机辅助分析电泳图象，对感兴趣蛋白进行酶解，质谱分析，数据库检索，蛋白质鉴定，分析蛋白质在细胞和组织中的表达情况。二维凝胶电泳技术早在1975年就由0’ Farrell建立起来，包括第一维上的pH等电聚焦和第二维上的SDS凝胶电泳，使蛋白质分别按不同的等电点和荷质比进行分离。但凝胶电泳在灵敏度上有着先天的局限性， 银染条件下的最小检出量只有0. Ingo随着蛋白质组学研究的深入，研究单个细胞的全部蛋白，特别是低丰度蛋白成了目前亟待解决的关键问题。但是单个细胞的蛋白量远远达不到一般电泳的上样量，重要的低丰度蛋白质分子根本无法检出，或者被大量表达的蛋白将其覆盖。目前，人们发展了精度更高的二维色谱0D-LC)，二维毛细管电泳0D-CE)，液相色谱-毛细管电泳(LC-CE)等新型分离技术来应对这一蛋白质组学中的关键问题，但都存在操作复杂费时，效率低，无法获得蛋白间相互作用等多维信息的问题。 原子力显微镜(AFM)专利技术于上世纪80年代，具有原子级分辨能力和纳米级操纵能力，是在纳米尺度和单分子级别进行表征和操纵的重要工具，特别适用于在原有生物环境中对生物大分子的结构和力学性质进行分析。目前，应用AFM在固体-液体界面观察蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的长度、形状、体积、微结构，并对它们进行针尖-分子、分子-分子间相互作用力的测量，以及拉伸、切割、移动等操纵的技术已十分成熟。AFM操作简单，无需染色，所得信息真实、多样，完全满足单细胞蛋白质组学的研究要求。但AFM检测要求在平坦的基底上进行，样品与基底间要有一定作用力，溶液中也不能有干扰针尖的杂质存在。而传统的二维电泳是在凝胶中进行的，不适合AFM即时检测。因此，至今国内外还没有二维电泳与AFM检测相结合的相关报道。 高灵敏C⑶技术的发展使单分子荧光检测越来越便捷和高效。EM(XD(EleCtr0n Multiplying (XD)技术是一种全新的微弱光信号增强探测技术，由Andor TechnologyLtd.首先应用于2001年发布的iXon系列高端超高灵敏相机上。该技术在固体成像器件中嵌入可控的电荷雪崩倍增寄存器，使信号电荷在读出过程中得到雪崩增强，具有是高量子效率、高灵敏度、高信噪比、高空间分辨率、高读出速率、高帧速工作和可变的增益控制等特点，克服了传统ICXD(Intensified (XD)背景噪声大、光电效率低等诸多缺点。EMC⑶在对极微弱光信号的实时快速动态检测方面具有先天优势，其灵敏度可达到真正的单光子水平，非常适合单分子荧光检测。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是对现有双向电泳技术进行改进，提供一种，使其在单细胞水平上进行，并与AFM或高灵敏CCD检测结合，实现单分子层次上的检测。可用于蛋白质组学及细胞生物学等领域。 技术方案本专利技术单细胞组学的方法，其双向电泳分离过程在固体-液体界面上进行，或者在薄层凝胶中进行。在固体-液体界面上进行的电泳中，电泳物质与基底间有一定相互作用力，主要包括静电力和疏水作用力。蛋白、核酸、多糖等生物分子自身带有大量电荷，基底的二氧化硅层表面由于氢氧根电离而带电，不同的功能化基团的单分子层也带有电荷。它们之间存在静电作用力。带有疏水基团的单分子层与电泳物质间存在疏水作用力。在外加电场作用时，带电生物分子克服基底结合力和摩擦力，以爬行状态局限在界面上并在电场方向上移动。这种界面电泳方式，为AFM的即时检测提供了良好平台。由于 AFM的加入，检测精度大大提高，电泳物质的量可以很少。本专利技术取单个细胞的内容物进行电泳。根据需要，电泳的目标物质可以是单细胞内容物的某些组成部分，如全部或部分的蛋白、DNA、RNA或它们之间形成的复合物。通过选择自组装单分子层的种类，以及加入了溶液与基底间的垂直电场，可以控制电泳物质与基底的作用力。在电泳时，较弱的作用力可以加速电泳的进行；而在AFM检测时，较强的作用力可以有助于得到准确的图像。 高灵敏度CCD技术的发展，使得单分子荧光检测高效而简单。本专利技术取单个细胞的内容物进行电泳，并把电泳改在薄层凝胶中进行的。薄层电泳介质可以减少荧光在介质中的损耗，用助于微弱的单分子荧光的检测。应用高灵敏度CCD检测生物分子的激光激发荧光，可以是分子本身受激发出的荧光，或是荧光标记受激发出的荧光。 本专利技术包括以下步骤 步骤1 将单个细胞移动到基片上并破碎，使其内容物流出； 步骤2 施加电场，对单细胞内容物进行双向电泳； 步骤3 对电泳产物进行高灵敏度检测； 步骤4 将分离与检测结果制成数据库，便于比对。 单细胞双向电泳的方法，按如下步骤进行 a.在硅片上蒸镀电泳所需的钼电极； b.按需要在硅片上修饰功能化自组装单分子层，或加入薄层凝胶； c.加入用于形成PH梯度的电解质溶液和电泳液； d.取单个细胞转移到硅片上，并破坏细胞，使其内容物流出； e.施加一个方向的电场，进行等电聚焦电泳； f.施加另一个方向的电场，使生物分子按荷质比进行电泳； g.选择性的施加垂直方向电场，控制生物分子与基底的结合力； h.用AFM或高灵敏CXD对电泳分离物质进行检测； i.将分离和检测结果制成数据库。 单细胞内容物双向电泳时，参与电泳的物质为单个细胞的内容物。单细胞内容物双向电泳过程发生在固体-液体界面上，或薄层凝胶中。单细胞内容物双向电泳时，所述固体-液体界面为硅片或硅片上的组装单分子层与溶液间的界面。单细胞内容物双向电泳施加的电场是通过在基片上蒸镀钼金属层作为电极来施加。单细胞内容物双向电泳过程中施加了垂直方向的电场来控制双电层和电渗流。所述高灵敏度检测是指应用AFM或高灵敏 CCD检测电泳产物。 有益效果本专利技术所述的，具有以下优点 1.本专利技术仅对单个细胞的内容物进行分离，分离精度高，能得到大量细胞系综平均后被掩盖的单细胞特性； 2.本专利技术对生物分子的检测可以精确到单个分子的水平； 3.本专利技术能得到生物分子在电泳过程中的连续时间过程，可用于研究生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于单细胞组学的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：　　　　步骤１：将单个细胞置于基片上并破碎，使其内容物流出；　　　　步骤２：施加电场，对单细胞内容物进行双向电泳；　　　　步骤３：对电泳产物进行高灵敏度检测；　　　　步骤４：将分离与检测结果制成数据库，便于比对。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖忠党，田田，王海涛，朱钊奇，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]