鼠抗醋酸甲羟孕酮(MPA)的单克隆抗体制造技术

本发明专利技术提供了一种鼠抗醋酸甲羟孕酮（ＭＰＡ）的特异性单克隆抗体Ｍ６８Ｆ９。该抗体由鼠源性杂交瘤细胞系Ｍ６８Ｆ９产生，属于ＩｇＧ１亚类免疫球蛋白，具有与ＭＰＡ结合特异性强，灵敏度高，亲和力大的特点。

【技术实现步骤摘要】
鼠抗醋酸甲羟孕酮(MPA)的单克隆抗体
-本专利技术属于兽药检测和免疫学分析
，具体涉及一种鼠抗醋酸甲羟孕酮的单克隆 抗体及其分泌抗体的杂交瘤细胞株。
技术介绍
醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone Acetate, MPA)是一种孕激素类妇科药物，黄体酮 衍生物，化学名为6a-甲基-17a-羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮醋酸酯，分子式为02483404，又称甲 羟孕酮、甲孕酮、安宫黄体酮，主要用于妇女绝经期综合征疾病等激素替代疗法。MPA和其 他同化性激素药物一样具有安情助长作用，MPA对动物有增肥作用，多用在词料中作为促生 长剂和非发情期诱导发情、诱发超数排卵、同步发情等方面，以提高繁殖率和经济效益(高 彦生等，2002)，例如牛、羊、猪、鸡、鱼等的饲料。但MPA可对人造成广泛副作用，体重增 加、虚弱、疲乏和不可逆高血压、脱发以及不规则出血、闭经、精神抑郁、失眠、恶心、乳 胀等不良反应，甚至导致不孕不育症，也有专家担心这种生长激素还可能具有导致细胞快速 增殖的危险。由于MPA作为饲料添加剂在动物体内不断累积可导致动物性食品中该药的残留， 从而严重威胁着人类健康。自2002年欧盟发生的MPA污染事件后，MPA的兽药残留问题引起世界的广泛关注。欧盟 (EU)已明令严禁使用MPA，规定在食源性动物产品中残留最高限量(MRL)为"不得检出"。 但是仍存在非法使用的现象，并且在美国、澳大利亚等一些国家还未禁止MPA的使用，因此， 加强动物词料和食品中MPA检测非常重要。目前用于MPA检测的确证方法是气相色谱一质谱 (GC/MS)法(庄无忌，2003)，但该法仪器昂贵，检测成本较高，检测周期较长，技术也比 较复杂。MPA免疫学分析方法敏感、特异、快速已成为国内外研究热点，制备出特异性强、 效价高的MPA抗体是进行MPA免疫学分析方法研究的首要条件。目前国外已有以多克隆抗体 为基础的商品化MPA检测的酶免疫技术(EIA)试剂盒(如5131MPAlp08.05)，国内有关 于MPA人工抗原合成、多克隆抗体制备和ELISA检测的报道(郭金花，2006;孙武勇，2007; 杨泽晓，2008)，但是还没有注册商品号的相关MPA检测试剂盒生产，也未见MPA单克隆抗体 研究的报道。申请人只检索到一篇主题相关的专利文献，文献号02125370.6，专利技术名称为 一种检测醋酸甲羟孕酮含量的试剂盒及其检测方法。多克隆抗体常受到人工抗原合成批次、 免疫剂量、试验动物、免疫时间、免疫血清储存时间等多种因素的影响，很难提供标准化的 相关试剂，而单克隆抗体特异性强、均质性好，效价高、稳定廉价，有望解决多克隆抗体不 易标准化等缺点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于利用免疫学技术得到抗MPA的单克隆抗体。 本专利技术目的在于利用B淋巴细胞杂交瘤技术获得一株能够稳定分泌MPA特异性抗体的 杂交瘤细胞株M68F9，并提供进行饲料和食品中MPA残留量免疫学分析所需的单克隆抗体。 该抗体为一株稳定的鼠源性杂交瘤细胞株所分泌的IgGl型免疫球蛋白，能够与MPA发生特 异性免疫反应。本专利技术的目的通过下述技术方案实现，即MPA单克隆抗体的制备方法(l)分别采用碳 二亚胺法、混合酸酐法将MPA偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)上制备 免疫原(MPA-BSA)与包被原(MPA-OVA); (2)通过BALB/c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA 和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆亚克隆获得分泌MPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(3) 通过F丄ISA方法对其抗体效价、特异件、敏感性、亚类及稳定性进行鉴定。附图说明图1图示的是人T.抗原MPA-BSA与MPA-OVA的紫外扫描鉴定结果。本专利技术的优点本专利技术所提供的杂交瘤细胞株M68F9分泌MPA特异性抗体的性能稳定，所分泌的单克 隆抗体特异性强，亲和力良好，其间接竞争ELISA敏感度可达0.05-0.01 ng/mL。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于 说明本专利技术而绝不对本专利技术的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语 都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专 利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常 规条件例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。实施例实施例1人工抗原MPA-BSA与MPA-OVA的合成鉴定首先将MPA与盐酸羟胺反应生成HON=MPA，再与琥珀酸酐反应制得MPA-HS，最后 分别通过碳二亚胺法、混合酸酐法将MPA偶联到牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA) 上制备免疫原(MPA-BSA)与包被原(MPA-OVA)。1.1 MPA的肟化称取85 mg (约0.25 mmol) MPA溶于20 mL甲醇，与溶于10 mL双蒸水的盐酸羟胺(21 mg)混合，在冰浴条件下反应2.5h，其间滴入0.05 mol/L的NaOH溶液约7 mL。反应后滴 入醋酸盐缓冲液约5mL，并加入碎冰约25mg，出现白色沉淀，在4"下静置ld，获得肟化 MPA(HON-MPA)。同时，按1:2取一定量GF254硅胶和0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 水溶液研磨均匀至糊状，涂布于玻璃板上自然晾干，制备薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)板，以氯仿为展开剂对反应产物和MPA进行TLC监测。1.2 MPA的酰化将1.1中反应液3000X g离心20 min，弃上清液，取出A色沉淀用20 mL 二甲基甲酰胺 溶解后，加入50mg琥珀酸酐，室温反应2h，随后加入三乙胺100ML，继续反应1 h，制备 酰化产物(MPA-SH)同上以氯仿丙酮(10:1)为展开剂对反应产物和肟化MPA进行TLC分析。1.3 MPA-BSA的合成称取400 mg BSA溶于10 mL 0.01 mol/L PBS (pH8.0)溶液中，各加入100 mg EDCI，然后逐滴滴加上述酰化产物，反应lh后，再加50mgEDCI，闭光搅拌反应过夜。收集反应 液用双蒸水透析2d，此过程换液3-5次，然后置于FTSEI585-Q冷冻T燥仪中冷冻干燥，一 70'C保存备ffl。1.4 MPA-OVA的合成称取50mgOVA溶于10mL0.01mol/LPBS (pH8.0)溶液中，逐滴滴加上述反应产物， 用1 mol/L的NaHC03调节pH值为9.0，室温搅拌1 h后，置4。C搅拌反应过夜。同1.3进行 透析、冷冻、干燥和保存。1.5 MPA人工抗原的紫外线扫描法鉴定精确称取一定量的MPA、 BSA、 OVA、 MPA-BSA和MPA-OVA，溶解于超纯水屮，使 其浓度分别为20 lag/mL、 100 lag/mL、 100|ag/mL、 100 ng/mL和100 |ig/mL的溶液'在ND-1000 紫外分光光度计进行扫描，记录结果，并按照相关文献进行偶联比估算。1.6 MPA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫球蛋白，其特征在于，它是特异性的结合醋酸甲羟孕酮（ＭＰＡ）的单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩雪清，林祥梅，吴绍强，梅琳，刘建，贾广乐，杨泽晓，侯义宏，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]