一种检测单核苷酸多态性的方法技术

技术编号:2575989 阅读:186 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术提供一种联合内切酶和外切酶以及质谱法方法来检测单核苷酸多态性的新方法。本发明专利技术要点在于参与PCR反应的其中一条引物含限制性内切酶的识别位点,通过对PCR产物进行限制性内切酶消化,以及随后的双链DNA外切酶消化,产生两个含多态位点的单链核苷酸片段,并通过纯化、点靶等步骤,制备可直接用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测的样本。与现有方法相比,本发明专利技术具有存在耗时短、成本低、分辨率高、操作简便的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到基因组学和分子生物学中有机生物分子特别是核酸分子的质 谱分析,具体是提供一种联合限制性酶切法、核酸外切法和质谱法以检测单核 苷酸多态性的方法,更具体地说,提供一种在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)中对基因组单核苷酸多态性进行检测的方法。技术背景人类的遗传信息储存在基因组中,2002年国际合作项目人类基因组计划的 最终完成,绘制出了人类基因组结构的精细图,为相关研究提供了参考序列。 人类基因组序列共由30亿个位点组成,研究表明,任意两个人之间的基因组差 异在0.1%左右,即大约300万个位点的差异。这些差异极有可能是造成两个人 之间个体差异的遗传因素。发现这些位点,可广泛地应用于遗传标记的研究、 评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。在人类基因组中,约90%的差异是以单个核苷酸的形式体现出来的,这样 的差异位点被称作单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP 具有两个显著的特点 一是数目众多,据估计人类基因组中的SNP数目约在1100 万左右,目前国际数据库dbSNP中已收录来源于人类基因组的SNP达1083万, 其中经过确认的为644万(截至2007年8月22日),如此大量的SNP方便了研 究这选择合适的位点进行研究,也使得绝大多数基因组区域在SNP效力的覆盖 范围内;另外一个特点是SNP位点大多数为双态,即在一个位点上仅有两种表 现形式(基因型),这样很容易就能设计出高通量自动化的检测方法。正因为这 两个特点,使得SNP位点越来越受到研究者的青睐,被誉为是继限制性片段长 度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)和短串联重复序 列(shorttandemrepeat, STR)之后的第三代分子标记物。人类基因组计划完成 前后,基因组学研究的重点逐渐转向SNP领域,因此,SNP在遗传标记学、生 物群体遗传学、生物分类学、遗传育种学、物种或人类进化学、法科学、药物 基因组学等领域都有重要的应用。例如,SNP的丰富性和双等位基因特性使作物或家畜遗传作图更加精细, 使得育种工作者能够更精确的进行标记辅助选择(MAS)和标记辅助导入(MAI), 降低或消除了目的基因之外的遗传背景对这些技术带来的不良影响,同时也给 品种资源和品种纯度鉴定带来崭新局面。姜运良等人通过对3种"双肌臀"猪 品种的肌肉生长抑制基因3个不同位点进行分析,获得肉质提高的新品种。Mo皿a等人利用SNP标记技术成功地将水稻半矮杆基因sd-l图位克隆,Shen 等人构建了水稻全基因组SNP数据库,并成功地筛选多个水稻功能基因。例如,不同个体中存在的SNP差异,成为了法科学中身份鉴别的有力工具。 Gabirel等人对105个样本的线粒体HVI/HVII区域的SNP进行分析,并用途分 析了实际案例中毛发和骨骼等检材,证明了该方法用于法医检案是可行的。李 莉、李成涛等人对人HLA-DR基因的SNP进行检验,在应用于亲子关系鉴定的 25个案例中,成功率达到96%。为了抢占市场,各大生物学公司都推出了自己的SNP检测方法。其中质谱 仪被认为是很有发展前途的仪器,尤其是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (MALDI-TOFMS)。基于MALDI-TOF MS,开发了一些SNP检测方法,如美 国Sequenom公司的hME和iPLEX方法,德国Bruker公司的GOOD assay方法, 韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。这些方法的原理是设计一条与待检测SNP 位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针,根据SNP位点的基因型差异,探 针将在待检测SNP位点处连接上不同的脱氧核苷酸。其中,组成DNA片段的 四种脱氧核苷酸的分子量分别是dAMP 313.21Da, dCMP 289.19Da, dGMP 329.21Da, dTMP304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的,其中差 异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da,差异最大的是dCMP与dGMP之间 的40.02Da,通过质谱仪能检测到这种差异,从而将分子量不同的探针区分开来。 质谱仪的检测效果与探针的分子量相关,探针片段越短,分子量越小,区分效 果越明显例如,在图1中,A图标示的两个峰,对应的两个寡核苷酸片段为 5'-ACGT-3,和5,-ACGA-3,,分子量分别为1174.699和1183.770Da,相差9.071Da, B图标示的两个峰,对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGT-3'和 5,-ACGTACGA-3,,分子量分别为2410.628和2419.821Da,相差9.193Da, C图 标示的两个峰,对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGTACGT-3'和 5,-ACGTACGTACGA-3,,分子量分别为3645,917和3654.736Da,相差8.819Da, 同样相差9Da左右,但如图所示,A图中两个峰之间的差异最明显,B图次之, C图中两个峰之间的差异相对不明显,也就是说,分子量越小,质谱仪的区分效 果越明显,即分辨率越高。为了提高质谱仪的分辨率,对SNP位点进行检测倾 向于检测分子量较小的寡核苷酸片段,如RFMP方法通过对含SNP位点的PCR 产物进行限制性酶切,产生2000~4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测,而 GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase, PDE)将含SNP位点的 寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段进行检测。然而,国外公司利用质谱仪对SNP位点进行检测的方法,在实际应用中存在不少缺陷(1) S叫uenom公司的hME、 iPLEX两种方法采用的是两步PCR,即第一次PCR放大待检测SNP位点的拷贝数,第二次PCR对待检测的SNP位点进行检 测,在两次PCR之间,还要使用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)除去第一次PCR反应体系中剩余的dNTP,这样就造成总检测时间的延长, 以及单个检测成本的增加;此外,这两种方法没有对含SNP位点的寡核苷酸片 段进行切割,检测范围在4000 9000Da之间,因而分辨率不高;(2) GOOD assay方法也采用了两步PCR,而且,为了提高分辨率,采用磷 酸二酯酶切割含SNP位点的寡核苷酸片段,提高了成本,延长了时间,不利于 快速检测;(3) RFMP方法只有一步PCR,但是同GOOD assay方法(1000~2000Da) 相比,产生待检测片段过长(2000 4000Da),相应的,分辨率不如GOOD assay 方法。因此,基于MALDI-TOFMS,目前需要开发一种分辨率高、准确、成本低、 快速的方法来检测基因组中SNP位点。
技术实现思路
本专利技术是在针对以往基于MALDI-TOF MS检测基因组SNP位点的方法存 在的前期处理速度慢或捡测分辨率不够高等问题提出的相应的解决方案。本专利技术原理在于利用酶切位点位于识别位点下游的一类特殊限制性内切 酶的独特性质,通过将识别位点引入用于扩增SNP位点的正向引物中本文档来自技高网
...

【技术保护点】
一种联合限制性酶切法和质谱法以检测单核苷酸多态性的方法,包括以下步骤:    (1)确定SNP位置:针对待检核酸序列可能存在的SNP,确定SNP在待检序列中的位置;    (2)设计正向引物:根据SNP的位置,设计正向引物,其中正向引物3’端位于SNP位点5’端1-10bp处,正向引物5’端含有特殊限制性内切酶的识别位点,而在待检核酸序列中,所述的特殊限制性内切酶的酶切位点位于识别位点的3’端1-10bp,并位于SNP位点5’端1-5bp;    (3)设计反向引物:根据SNP的位置,设计与另一条核酸链或互补链上的SNP位点的5’端序列互补的反向引物;    (4)PCR扩增:通过PCR扩增,获得包含特殊限制性内切酶的识别位点+酶切位点+SNP位点+SNP位点的部分下游序列的扩增产物;    (5)限制性内切反应:使用所述的特殊限制性内切酶进行限制性内切反应,获得具有粘性末端的双链核酸片段,其中粘性末端中包含SNP位点;    (6)双链DNA外切反应:利用双链DNA核酸外切酶,切下双链核酸片段的粘性末端,获得两条包含SNP位点并且互补的单链短片段;    (7)质谱检测:将包含SNP的单链短片段进行质谱检测,通过与野生型单链短片段的分子量进行比较,确定SNP的基因型。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:赵洪斌马庆伟于中连吕芳吕萍萍
申请(专利权)人:毅新兴业北京科技有限公司
类型:发明
国别省市:11[中国|北京]

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1