用于吸附、分离、检测超微量靶蛋白的系统及其用途技术方案

该发明专利技术提供一种用于吸附、分离、纯化、检测微量靶蛋白的系统，包括分离填料、用于固定分离填料并使其与溶液结合以及吸取溶液的中空管。本发明专利技术将蛋白微珠芯片中的微珠粒子，应用于层析洗脱分离领域，即将其作为层析分离柱中的载体，并将常规的层析分离柱环境创造性改变成类似于移液器枪头环境，从而获得能在同一环境中进行上样、吸附、洗涤、洗脱、浓缩、鉴定同时还具有蛋白微珠芯片高特异性的应用效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到蛋白组学和分子生物学中生物液体样品中超微量靶蛋白的分离，具体是提 供用于分离、检测生物液体中超微量靶蛋白的系统及其使用方法。技术背景随着生命科学的研究迅速进展，生物样品中靶蛋白的分离方法日益受到科研工作者的关 注。科学家们发现，随着蛋白的检测很多很灵敏准确的方法，如荧光定量PCR仪、质谱仪等 的出现，目前限制蛋白质研究的问题是如何有效处理前期样品。目前也有很多处理生物样品中靶蛋白的方法。其中最常见的是层析洗脱分离法(色谱 法)，例如离子交换层析、选择吸附层析(如疏水作用层析、亲水作用层析、糖基化作用层析、 dextran作用层析、脂肪酸作用层析)、亲和作用层析(如生物素亲和作用层析、免疫作用层 析、凝集素作用层析、金属鳌合/配位作用层析、配体或受体作用层析、共价作用层析)等。 然而这些方法也有着很多缺陷限制其使用，如整个流程耗时很长、操作复杂(例如经过上样、 吸附结合、洗涤、洗脱、浓縮纯化)、需要具有经验的操作人员和复杂的仪器设备、操作前对 样品要求很高(样品纯度、不能有颗粒物等)。尤其是面对临床诊断，要求操作简单且并不需 要完全分离生物样品(例如分离血样中的磷酸化蛋白、糖蛋白等)。此外，近年来出现了用于分离微量蛋白的微珠芯片。蛋白质微珠芯片是指以生物分子微珠 作为配基，将其固定在固相载体的表面，形成的蛋白质微阵列。常见的微珠有PVDF微珠， 聚丙烯酰氨凝胶微珠、硝化纤维素膜微珠、聚苯乙烯微珠等等。然而这类微珠芯片有其固有 的缺点1、芯片特异性问题，这与芯片微珠表面修饰和修饰物都有关系，芯片微珠表面修饰 工艺不好或者修饰物间隔不合适都可能造成芯片微珠表面的非特异性吸附，修饰物的特异性 更是直接决定着芯片的特异性。2、芯片容量，芯片微珠的表面积有限，因此所修饰的修饰物 数量是一定的，因此，芯片容量也一直是微珠芯片的一个重要问题。3、是芯片微珠同样品的 结合不充分，芯片微珠同待检分子的结合属于平面结合，并且芯片微珠所需样品量很小，因 此不能保证芯片微珠同样品充分结合，这不像液体中两项能充分混合；4、芯片微珠洗脱不充 分，芯片是一个固体平面，洗脱不能完全洗涤微珠，可能造成干扰物质洗涤不完全从而影响 芯片微珠的特异性；5、修饰样品量小，对低丰度目标物质的检测能力有限。因此，需要提供一种特异性高、操作方便、省时省力、集吸附、分离、洗脱于一体的分离 微量靶蛋白的系统及其使用方法。
技术实现思路
本专利技术针对蛋白的分离纯化过程中所存在的问题，通过综合层析洗脱分离法和蛋白微珠 芯片法的优点，创造性专利技术了用于结合、分离、纯化耙蛋白的系统及其使用方法。该专利技术思路在于将蛋白微珠芯片中的微珠粒子，应用于层析洗脱分离领域，即将其作为 层析分离柱中的载体，并将常规的层析分离柱环境创造性改变成类似于移液器枪头(tip头)环 境，从而获得能在同一环境中进行上样、吸附、洗涤、洗脱、浓縮、鉴定同时还具有蛋白微 珠芯片高特异性的应用效果。因此，本专利技术第一个目的是提供一种用于吸附、分离、纯化、检测微量耙蛋白的系统。 该系统包括(1) 分离填料；和(2) 用于固定分离填料并使其与溶液结合以及吸取溶液的中空管；(3) 如果需要，分离填料上下面含有用于固定分离填料的支撑网；其中所述的分离填料是直径约在10-10、m级或10-103nm级的微珠组成，该微珠具有生 理性无毒、生物高相容性的高分子材料内层和可逆结合或释放靶蛋白的官能团外层。在一个具体实施方案中，所述的中空管上端孔直径大于下端孔直径，上端孔同移液器前 端吻合，分离填料被固定在中空管的中部或下部，通过移液器的吸取作用从下端孔吸入溶液 并接触分离填料。在另一个具体实施方案中，中空管可以类似于移液枪的枪头。 在另一个具体实施方案中，还可包括用于活化分离填料微珠的活化缓冲液。 在另一个具体实施方案中，用于制备所述的中空管和/或支撑网的材料是无机或有机惰性材料。其中惰性材料选自木质、纸质、塑料、玻璃、金属、矿物质。在另一个具体实施方案中，根据特殊修饰类型选择现有的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗 脱缓冲液、活化缓冲液，例如用于离子交换修饰、选择吸附修饰、亲和作用修饰中所用的各 种已知的结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、活化缓冲液。在另一个具体实施方案中，组成分离填料的微珠是经表面修饰的固体微珠。这些微珠的 材质很特别，可以是琼脂糖、聚丙稀酰铵、纤维素等物质形成的共聚物微珠，主要特点是具 有化学惰性，作用在于结合吸附微量靶蛋白，并最终被洗脱缓冲液洗脱靶蛋白。这些微珠很 微小，可以是微米级(10-10^im)的微珠也可以是纳米级(10-l(^nm)的微珠；而且微珠形状可以 制造成球形的，也可以制造成其他形状如立方体等。其中，所述微珠的内层高分子材料可以 选自用于微珠芯片的常规材料，例如聚多糖、聚酯、烯烃共聚物、聚氨化合物、聚酸化合物、蛋白、胶体物、二氧化硅、环氧化合物。其中聚多糖选自琼脂糖、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、 淀粉、环糊精或共聚物，聚酯选自聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(丙交酯-共-碳酸酯)、树脂、聚 氨酯、聚己内酯、纤维素酯、聚乙二醇、聚乙烯醇或共聚物其中烯烃共聚物选自聚砜、聚 醚砜、聚偏乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈或共聚物聚酸化合物选自聚乳酸、乳酸与乙醇酸 共聚物、聚羟基酸、3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物；蛋白选自胶原、纤维蛋白、纤维粘连 蛋白、白蛋白或共聚物；胶体物选自硅胶、明胶、罗望子胶、沙蒿胶、黄原胶、瓜尔豆胶或 共聚物；或以上任意组合的共聚物。因此，本领域技术人员根据试验目的，可自行选用各种 现有的微珠材料。在另一个具体实施方案中，根据所分离的靶蛋白，可对微珠官能团外层进行特殊修饰， 特殊修饰选自离子交换修饰、选择吸附修饰(如疏水作用修饰、亲水作用修饰、糖基化作用 修饰、脂肪酸作用修饰)、亲和作用修饰(如生物素亲和作用修饰、免疫亲和修饰、凝集素亲 和修饰、金属鳌合/配位亲和修饰、染料配体亲和修饰、核酸亲和修饰)。因此，所述特殊修 饰的官能团可选自-COOH、 -CHO、 -NH2、 -SH、 -S-S、环氧基、羰基。本专利技术的第二个专利技术目的提供利用所述的系统来吸附、分离、纯化、检测超微量蛋白的方法。其中，步骤包括(l)用结合缓冲液稀释或溶解含靶蛋白的混合物，和；(2 )将含有分离填料的中空管的上端孔套入移液器的前端，和；(3) 通过移液器，吸取含靶蛋白的结合缓冲液，并使其反复经过分离填料，使得靶蛋白通 过前述修饰的作用与微珠充分结合，和；(4) 弃去结合缓冲液，通过移液器吸取洗涤缓冲液，充分洗去未结合分离填料的杂质，和；(5) 弃去洗涤缓冲液，通过移液器吸取洗脱缓冲液，从分离填料洗脱靶蛋白，并收集靶蛋 白洗脱。在一个具体实施方案中，还包括在吸取含靶蛋白的结合缓冲液之前，用移液器吸取活化 缓冲液，以活化分离填料的微珠表面。本专利技术的第三个专利技术目的是提供上述的系统或上述的方法用于制备检测超微量靶蛋白 的产品中的用途。定义术语"靶蛋白"指由氨基酸、肽或多肽组成的任何目的蛋白质，包括抗原/抗体、膜蛋白、糖蛋白、弱酸弱碱蛋白、脂蛋白、金属亲和蛋白、抗体/抗体蛋白、磷酸化蛋白等)。术语"微珠"，又称"微球"、"微粒"、或"纳米粒子"，是用于层析吸附结合中具有生 物惰性的微米级或纳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于吸附、分离、纯化、检测超微量靶蛋白的系统，其特征包括：（１）分离填料；和（２）用于固定分离填料并使其与溶液结合以及吸取溶液的中空管；（３）如果需要，分离填料上下面含有用于固定分离填料的支撑网；其中所述的分离填料是直径约在１０－１０↑［３］μｍ级或１０－１０↑［３］ｎｍ级的微珠组成，该微珠具有生理性无毒、生物高相容性的高分子材料内层和可逆结合或释放靶蛋白的官能团外层；和其中所述的中空管上端孔径大于下端孔径，上端孔同移液器前端吻合，分离填料被固定在中空管的中部或上部，通过移液器的吸取作用从下端孔吸入溶液并接触分离填料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于中连，马庆伟，赵洪斌，吕芳，吕萍萍，
申请(专利权)人：马庆伟，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]