肿瘤坏死因子α基因的报告质粒与构建方法及其应用，涉及一种基因。提供一种基于荧光素酶报告基因的肿瘤坏死因子α基因的报告质粒与构建方法及其应用。从小鼠基因组ＤＮＡ中采用ＰＣＲ方法扩增肿瘤坏死因子α基因启动子及３’端非翻译序列，再克隆至质粒ｐＧＬ３的荧光素酶报告基因两侧的克隆位点。肿瘤坏死因子α基因的报告质粒的荧光素酶基因由肿瘤坏死因子α基因启动子及３’端非翻译序列驱动，荧光素酶基因的表达水平即反映了肿瘤坏死因子α基因的表达水平。肿瘤坏死因子α基因的报告质粒用于检测化合物对肿瘤坏死因子α基因表达水平的影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因，尤其是涉及一种基于荧光素酶(luciferase)报告基因的肿瘤坏死 因子a基因的报告质粒的构建及其应用。技术背景肿瘤坏死因子a (TNF-a)是一种具有重要生理功能的细胞因子。肿瘤坏死因子a主要由 巨噬细胞产生，产生细胞还包括淋巴细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞、成纤维细胞、星形胶 质细胞、表皮细胞和平滑肌细胞等。肿瘤坏死因子a具有广泛的生物学活性，例如参与炎 症反应和免疫应答；抗肿瘤；参与内毒素性休克、动脉硬化、静脉血栓形成和脉管炎等病理 过程；引起恶液质。在医学临床诊断、科学研究等领域，常常需要测定肿瘤坏死因子a基因的表达水平。肿 瘤坏死因子a的传统检测方法基于酶联免疫反应法(Enzyme linked immunosorbent assays, ELISA)，其缺点在于过程繁琐、检测操作耗时长、试剂价格昂贵"Bioscience TNFa ELISA 检测试齐U盒；Mouse TNFa (Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-alpha, TNF-a) ELISA Ready-SET-Go! CAT#: 88-7324-88)。肿瘤坏死因子a基因的报告质粒可有效反映肿瘤坏死因 子a基因的表达水平(Beutler B， Brown T. A CAT Reporter Construct Allows Ultrasensitive Estimation of TNF Synthesis, and Suggests that the TNF Gene has been Silenced in Non-macrophage Cell Lines. J. Clin. Invest, 1991, 87: 1336-1344)，目前常用的肿瘤坏死因子a 基因的报告基因为氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)基因，氯霉 素乙酰基转移酶的传统检测方法需要使用放射性标记的化合物(J.萨姆布鲁克，DW拉塞尔 著.黄培堂等译.分子克隆实验指南(第三版).北京科学出版社，2002， 1354-1355)， 而使用ELISA的新方法的缺点上面己有叙述(叶平，方红，周新，等.非诺贝特和吡格列酮 对心肌细胞肿瘤坏死因子-a表达的影响及机制.中国药学杂志，2004， 39 (4) : 258-261)。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种基于荧光素酶(lucifemse)报告基因的肿瘤坏死因子a基因的报告 质粒。本专利技术的另一目的在于提供一种肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法。本专利技术的另一目的是应用带有肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的细胞株(即肿瘤坏死因 子a基因报告细胞株)检测化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响。本专利技术所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒构建自商品化质粒pGL3，即将肿瘤坏死 因子a基因的两个调控元件肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)和肿瘤坏死因子a基因 3，端非翻译序列(3'-UTR)插入质粒pGL3所含的荧光素酶(luciferase)报告基因两侧。构 建完成的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒所含的荧光素酶报告基因的表达由肿瘤坏死因子a 基因的两个调控元件调控，将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒稳定转染入细胞后，化合物对 荧光素酶报告基因表达的影响即代表该化合物对肿瘤坏死因子a基因表达水平的影响。可有效反映肿瘤坏死因子a基因表达水平的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的核心序列 为荧光素酶(luciferase)报告基因、肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter)及3，端非翻译 序列(3'-UTR)组成的重组DNA序列，或者通过上述核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的 缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列；可有效反映肿瘤坏死因子a基因表达水平的肿瘤坏 死因子a基因的报告质粒的核心序列的连接顺序为肿瘤坏死因子a基因启动子(promoter) -荧光素酶报告基因-肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列(3'-UTR)。本专利技术所述的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的构建方法包括下列步骤1) 从小鼠基因组DNA中采用PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因 子a基因3'端非翻译序列；2) 将肿瘤坏死因子a基因的两个调控元件肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a 基因3'端非翻译序列克隆至质粒pGL3的荧光素酶报告基因两侧的克隆位点，即构建了肿瘤 坏死因子a基因的报告质粒。上述构建好的肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的荧光素酶报告基因由肿瘤坏死因子a基 因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非翻译序列驱动，因此，荧光素酶基因的表达水平即反 映了肿瘤坏死因子a基因的表达水平。在步骤l)中，PCR方法扩增肿瘤坏死因子a基因启动子和肿瘤坏死因子a基因3'端非 翻译序列的引物对包括肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对和肿瘤坏死因子a基因 3'端非翻译序列的PCR扩增引物对。肿瘤坏死因子a基因启动子的PCR扩增引物对为正向引物5' AAAGGTACCATTCTGTCTGCTTGTGTCTGTCTTG 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶《/wI的酶切位点)；反向引物5' GGGAAGCTTGGTGTCTTTTCTGGAGGGAGATGTG 3，(下划线标注的序列为限制性内切酶///wd III的酶切位点)。肿瘤坏死因子ot基因3'端非翻译序列(3'-UTR)的PCR扩增引物对为正向引物5，GGGTCTAGAAGGGAATGGGTGTTCATCCATTCTC 3，(下划线标注的序列 为限制性内切酶BawH I的酶切位点)；反向引物5,AAAGGATCCATGGATGCAGACTTCATCCCAAGAC 3，(下划线标注的序 列为限制性内切酶jaal的酶切位点)。以下给出稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的 建立方法，其具体步骤为1 )将肿瘤坏死因子a基因的报告质粒和带新霉素抗性的筛选标记质粒用Fugene6转染试 剂共转染小鼠巨噬细胞株RAW 264.7;2) 共转染后，将小鼠巨噬细胞株RAW 264.7消化后转接到细胞培养皿中，培养液可为 Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(含8% 10%的胎牛血清，即FBS);3) 在培养液中加入G418 (新霉素类似物)(终浓度为300 400吗/mL)进行筛选；筛 选期间换培养液的间隔时间为3 4 d;4) 待克隆大小为肉眼可见时，挑取克隆至多孔板中培养，每个克隆转接l个孔，待细胞 长起后转接至另一多孔板，每个克隆转接2个孔，用于阳性克隆的筛选；5) 培养24h后，在转接克隆的一个孔加入细菌脂多糖(LPS)至终浓度为100 200ng/mL， 5 6h后用裂解液裂解细胞，测定裂解液的荧光素酶活性细菌脂多糖刺激下的荧光素酶表 达量比细菌脂多糖未刺激的荧光素酶表达量至少有50倍增大，则表明该克隆为阳性克隆，此 克隆即为稳定转染肿瘤坏死因子a基因的报告质粒的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株。上述所得的肿瘤坏死因子a基因报告细胞株需进行可行性验证，即在细菌脂多糖(LPS) 刺激的不同时间点测定肿瘤坏死因子a基因报告细胞株的裂解液的荧光本文档来自技高网...
【技术保护点】
肿瘤坏死因子α基因的报告质粒，其特征在于其核心序列为荧光素酶报告基因、肿瘤坏死因子α基因启动子及３’端非翻译序列组成的重组ＤＮＡ序列，或者通过上述核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷酸序列，上述核心序列的连接顺序为：肿瘤坏死因子α基因启动子－荧光素酶报告基因－肿瘤坏死因子α基因３’端非翻译序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：俞春东，赵扬，陈强，成卓，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]
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