本发明专利技术公开了一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别α－１抗胰凝乳蛋白酶和／或锌－α２糖蛋白。本发明专利技术的检测试剂盒是利用生物化学试验来分析肾移植术后病人早期尿液中的特异蛋白标志物，达到早期诊断肾移植急性排斥反应的目的，检测方法独特，特异性高，具有极大的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及肾移植急性排斥反应早期病人尿液中出现的三种标志物候选蛋白，即a -1抗胰凝乳蛋白酶 (alpha-l-ant ichymotryps in , AACT )、 锌-a2 糖蛋白(Chain A， Zn-Alpha-2-Glycoprotein , ZAG)和月中瘤排斥抗原 gp96(tumor rejection antigen gp96,也称GRP94)。利用针对上述三种蛋白的 特异抗体可以制备肾移植急性排斥反应早期诊断试剂盒，该试剂盒可以 用于临床早期诊断肾移植急性排斥反应。
技术介绍
肾移植急性排斥反应(简称急排)仍然是妨碍移植肾存活率的主 要因素，发生急排时的成功救治要求早期诊断并且及时给予充分治 疗。通常诊断发生急性排斥反应的指标有患者临床表现、各项生化 指标和组织活检。前两项不是绝对可靠的，主要依赖于临床医生的临 床经验来判断。血清中肌酐水平的增高通常是诊断移植肾衰竭 (allograft dysfunction)的一个非常有效的指标，但这项指标是 非特异的，并且不能反映早期肾功能的改变。被认为是诊断肾移植排 斥反应的"金标准"是组织活检，但据报道，用组织活检确诊的病人 中，只有不到30%被成功挽救。而且组织活检花费大，属创伤性检 查常伴随并发症，包括疼痛，血尿，肾血肿，移一直物血纟全症，败血 症，休克和移植物衰竭等。近些年诊断肾移植急性排斥反应的发生， 一直朝着寻找非侵入性的4企测方向努力。主要有以下方面1、 一企查血液中的可溶性粘附 分子，细胞因子，尿激酶，纤溶酶原激活受体，淋巴细胞表达的细胞因子，perforin, granzyme B和FAS酉己体；2、才t观'J尿液中的IL—2，沣占 附分子，补体C4d,尿激酶，纤溶酶原激活受体；3、其他，包括分析 尿液纟田月包中 granzyme B， perf or in, granulys in and CD103的mRNA 的表达水平，还有用免疫组化的方法4企测各种T细胞标志物。然而这 些检测方法由于特异性和敏感性等问题而都没有被临床广泛应用。尿液来源简单方便无损伤，病人容易接受，无不适感，没有禁忌 症。与组织活一企相比，尿液可以反应肾脏的整体情况，可以更及时准 确地反应肾脏的生理状态和功能水平。鉴于以上原因，选择尿液作为 寻找排斥反应标志物的研究对象，寻找肾移植患者尿液中蛋白标志物 来作为早期诊断急性排斥反应发生的指标，进而研制早期诊断急性排 斥反应的试剂盒将会产生极大的市场价值。
技术实现思路
专利技术人经过大量的实验研究发现，肾移植急性排斥反应病人在急性 排斥反应期间尿液中会出现一些特异性蛋白，而且还出现特征性的量 的变化。在急性排斥反应期间有些蛋白含量出现先升高，再降低，或者先 降低，然后逐渐恢复到最初水平，有这种变化趋势的蛋白，可能对排斥 反应过程的监测是有意义的。专利技术人通过实验发现，oc-l抗胰凝乳蛋白 酶(AACT)，锌-a2糖蛋白(ZAG)和肺瘤排斥抗原gp96 (GRP94)在肾 移植急性排斥反应过程中呈现出上述趋势。鉴于以上原因，专利技术人不仅 通过实验验证了上述蛋白作为肾移植急性排斥反应患者尿液中的蛋白 标志物的可行性，而且利用这些蛋白标志物进 一 步开发用于肾移植急 性排斥反应早期诊断的试剂盒。a-1抗胰凝乳蛋白酶(AACT)属于serpin超家族，是存在于人 血清中的 一个糖蛋白。它可以在体内抑制胰凝乳蛋白酶样的蛋白酶和 体内的细胞毒性T淋巴细胞活性，这个蛋白具有调控免疫和炎症过程 的活性，还可作为胂瘤标志物。锌-cx2糖蛋白(Zn-Alpha-2-Glycoprotein, ZAG),在氨基酸序列和结构域上与MHC抗原密切相关，与组织相容性1类抗原有着高度 的序列同源性。有证据显示这个蛋白属于免疫球蛋白基因超家族。锌 -a2糖蛋白可能是被剪切后的分泌性MHC相关分子，并且可能在免 疫应答过程中发挥作用。肺瘤排斥抗原gp96也称GRP94是热休克蛋白(HSP)家族成员， 具有抗原处理和递呈的功能，它可结合其他新生或异常蛋白质分子，起 着分子伴侣作用。本专利技术的目的是提供一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试 剂盒,使用该试剂盒能够特异识别肾移植急性排斥反应早期出现的蛋白 标志物，因此可以用来跟踪肾移植术后病人的进展，并能够早期诊断肾 移植急性排斥反应。本专利技术的另 一 目的是提供上述蛋白标志物在制备用于肾移植急性 排斥反应早期诊断的特异抗体的用途，利用其特异抗体可以制备用于 肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒。本专利技术的技术方案如下一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少 一种检 测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别a -1抗胰凝乳蛋白酶 和/或锌-oc2糖蛋白。上述用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒还可以含有特异 识别肿瘤排斥抗原gp96的捕捉试剂。上述捕捉试剂优选单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体或抗体片 段等特异抗体，所述特异抗体可以针对a-l抗胰凝乳蛋白酶和/或锌 -cc2糖蛋白，也可以是针对a-1抗月夷凝乳蛋白酶、《辛-a2^f唐蛋白和 肿瘤排斥抗原gp96。上述抗体可通过商业途径获得，还可以通过抗 体制备的常规方法来完成，如通过重组方法制备的杭体，如噬菌体展 示抗体，从转基因动物(如小鼠)中分离的抗体，用转入宿主细胞的 重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体。此外，也可以通过表达和纯化上述人源的标志物蛋白，用其免疫动物以获得 免疫血清，再用常规的方法纯化血清中的抗体而获得。上述捕捉试剂还可以是能够和a-l抗胰凝乳蛋白酶、锌-a2糖 蛋白和/或肿瘤排斥抗原gp96特异识别的其它化学试剂，应该说这些 化学试剂能够通过生化反应特异识别上述标志物蛋白，而不限于抗原 4元体i口、别方式。上述4企测试剂包含可4全测的标记成份，所述标记成^f分包括酶，辅 基，荧光物质，发光物质，生物发光物质、放射活性物质中的一种。 通过上述可4企测的标记物成份可以定性或定量测定样品中的标志物 蛋白。如上所述，酶可以是辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，beta-半 乳糖酶或乙酰胆碱醋酶；辅基的例子包括链霉菌抗生物素蛋白/生物 素蛋白和抗生物素蛋白/生物素蛋白；荧光物质的例子包括伞形酮， 荧光素，荧光素异硫氰酸醋，若丹明，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物 质的例子包括发光氨，生物发光物质的例子包括但不限于荧光素酶， 荧光素和水母发光蛋白；放射活性物质包括1251 ， 35S , 14C , 3H ， 或Mg52 。上述才全测试剂可以和捕捉试剂分装，也可以和捕捉试剂偶联。本专利技术的纟企测样品为肾移植术后病人的尿液；上述冲全测试剂盒还含 有必要的检测所需的稀释试剂或緩冲试剂。制备本专利技术检测试剂盒，可以通过市场商业途径获得试剂盒中的捕 捉试剂、检测试剂和必要的稀释緩冲液，其中本专利技术的实施例中的捕捉 试剂采用的是商业来源的特异抗体，当然也可以按常规抗体制备的方法 制备得到。上述试剂盒的各组分只需常规使用，无需特别操作，可以按 照各组成试剂使用说明来进行或按照常规实验方法操作，本领域技术人 员能够结合样品的特点正确使用^f企测试剂盒。上述标志物蛋白的识别检测载体不限于试剂盒的方式，其它检测载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于肾移植急性排斥反应早期诊断的试剂盒，包含至少一种检测试剂和捕捉试剂，所述捕捉试剂能够特异识别α－１抗胰凝乳蛋白酶和／或锌－α２糖蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贺伟峰，罗高兴，贾雄飞，吴军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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