本发明专利技术涉及一种创伤血清对炎性细胞ＮＦ－κＢ的激活作用检测及其用途，用于早期判定严重创伤患者炎症反应状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种创伤血清对炎性细胞NF-ic B的激活作用检测及其用途，用于 早期判定严重创伤患者炎症反应状态。技术背景大量研究证实，核因子kB (nuclear factor kB ， NF-kB)的活化在介 导促炎细胞因子的分泌方面扮演重要角色。有学者基于对NF- k B的过度活化在 脓毒症发生发展中的重要性认识，早期测定了严重脓毒症患者外周血中单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中的NF-k B活性，发现其 NF-kB活性的急剧增高与随后的死亡密切相关，表明其活性测定对严重脓毒症 95患者的不良结局具有重要的预测价值。但对于严重创伤患者，PBMC中的NF- ic B 活性测定对其预后判定并无参考价值。Adib-Co叫uy等发现，严重创伤患者PBMC 中的NF-!cB活性于伤后1、 3、 5、 IO天降低，但该变化与创伤血清中升高的抗 炎细胞因子白细胞介素10 (interleukin-lO， IL-10)和转化生长因子(3 (transforming growth factor-p， TGF-p)并无明显相关性，同时发现创伤患 者PBMC细胞核内的p65p50 / p50p50比值降低，但在伤后感染者与未感染者之 间、死亡者与存活者之间并无差异；Biberthaler等发现，严重多发伤患者外周 血中的单核细胞的NF- ic B活性于伤后6小时内急剧增高，但12小时后至伤后3 天即减低到难以检测的水平。Stegmaier等发现严重创伤患者外周血中的多型核 嗜中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的NF-k B活性于伤后 1.5小时及6小时时相点内急剧增高，且在死亡者组增加更为明显，存活组在24 小时时相点PMN的NF- k B出现第二次增高，48小时即降至难以测定水平。但PMN 的NF-KB活性与新的损伤严重度积分(new injury severity score, NISS)及 多器官衰竭(multiple organ failure, M0F)积分均无明显的相关性。表明严 重创伤患者外周血白细胞NF-icB活性于伤后早期(6小时内)急剧升高而随后 降低(即免疫麻痹状态)的变化对于创伤机体的预后判定，参考价值较小。尽管创伤后肝、肺组织白细胞中NF-k B的活化常持续更长的时间，但由于取材不便，古j[对其进4丁测定的J IS /宋丰旨导价值不大。业已证明，促炎细胞因子/抗炎细胞因子比值的测定较单一测定血清中促炎 细胞因子(如IL-1、 IL-6、 IL-8、 TNFa等)、抗炎细胞因子(如IL-IO、 sTNFR、 IL-lRa)更能客观地反应机体的炎症反应状态，并进而预测机体的器官功能的炎 性损害及死亡结局。但对创伤机体的反应而言，创伤血清中内毒素、TGF-p、 PGE2、 儿茶酚胺、糖皮质激素、胆碱、神经肽等水平均可出现不同程度的增高，这些因 子均参与介导了机体的促炎/抗炎反应过程并分别对免疫细胞的NF-icB活性产生正向/负向调节作用。因此如能综合测定严重创伤患者外周血清中上述众多因子(包括其他尚未发现的体液因子)共同对炎性细胞NF-icB活性的影响，则可更加客观地反映创伤机体的炎症反应状态，并用于预测创伤患者的不良结局。这对于指导严重创伤患者早期干预措施的实施、挽救其生命具有重要的临床意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供能够早期判定严重创伤患者炎症反应状态的方法。 本专利技术的另一目的是提供该方法的应用。本专利技术的另一 目的是提供一种试剂盒，含有pNF-icB-LUC质粒， Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。其中所述pNF-k B-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解 试剂，荧光素酶分析试剂，等均为现有技术，可以在市场上购买得到。将市场上购买到的试剂组成在一起包装，每个包装中，各试剂的量为i份到io份，本专利技术还提供本专利技术的试剂盒在检测创伤血清对炎性细胞NF-kB的激活度数值中的应用。其中所述的炎性细胞，是指单核/巨噬细胞、多型核白细胞、淋巴细胞、内皮细胞等细胞株或上述各类细胞的原代细胞。其中所述的炎性细胞是离体培养的炎性细胞。其中的激活度数值能够判定早期严重创伤患者炎症反应状态。其中所述分析，是将正常血清组与创伤血清组对NF- k B的激活度数值进行比较。其中所述比较，是将正常血清组与创伤血清组对NF- k B的激活度数值进行比较，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-KB的激活度数值明显增大，与正常血清组相比，MODS组、死亡组中所述增大分别较非MODS组、存活组更为明显。以上应用是用在创伤患者器官功能炎性损害及死亡结局的判定中。其中所述创伤患者器官功能炎性损害是指创伤患者脑、心、肺、肝、肾、胃肠功能的继发性炎性损害。本专利技术还提供一种创伤血清对炎性细胞NF- ic B的激活度数值的检测方法，其 特征在于，用本专利技术的试剂盒中的试剂进行检测，检测方法包括以下步骤1、 细胞培养将炎性细胞接种于96孔细胞培养板，调整细胞数为0.7X105/孔， 分为炎性细胞组、炎性细胞+pNF-KB-LUC(0.48ug)组、炎性邻胞 +PNF-k B-LUC(0.48ug) +正常血清(10%)组、炎性细胞 十pNF- k B-LUC(0. 48 u g) +创伤血清(10%)组。2、 质粒转染将0. 48 u gpNF- k B-LUC质粒加入50 y 1无血清无抗生素的1640 培养基中，混匀；将1. 2u 1Lipofectamine2000转染试剂加入50 y 1无血清 无抗生素的1640培养基中，在室温下混匀，放置5rain;将二者在室温下混 匀，放置20min;加入到上述相应细胞培养孔中，培养24h。3、 加入血清离心培养板，将各孔中的液体吸出，用D-Hanks液洗细胞1次， 于上述相应细胞培养孔加入正常/创伤血清20 u 1，并补加RPMI-1640完全培 养基至200ul/孔，使血清终浓度为10%，培养细胞6h。4、 裂解细胞离心培养板，将各孔中的液体吸出，用PBS洗细胞1次，于上述 各孔加入细胞培养裂解试剂100 u 1，作用10min;吸出液体至0. 5mlEp管中， 冰浴、旋涡振荡lmin，室温12000r.p.m离心2min;小心吸取上清，直接检 测或放入一70"C冰箱保存。5、 荧光素酶活性检测放好检测板，每孔加入100ul上清，再加入100ul荧 光素酶分析试剂，于免疫发光检测仪上立刻读数，打印或记录数据。本专利技术提供的检测方法是根据以下实验内容得到的。 创伤血清对NF- k B的刺激活性测定选择既往无心肺疾患、糖尿病、自身免疫性疾病史，ISS评分〉=16的多发 伤患者47例。伤后7天 21天并发多器官障碍综合征(MODS)者18例；未发 生MODS者29例；死亡13例；存活34例；正常对照组24例为接受体检的健康 人。所有创伤患者均按损伤的解剖部位计算ISS值，计算24小时APACHEII分值， 于伤后24小时左右收集外周血清，-8(TC冻存待测。巨噬细胞株RAW264. 7细胞(购自中国科本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种试剂盒，含有ｐＮＦ－κＢ－ＬＵＣ质粒，Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁华平，涂永久，黄健，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]
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