本发明专利技术属药物疗效检测技术领域，具体涉及一种肿瘤相关基因突变的实时ＰＣＲ检测方法及试剂系统。本发明专利技术针对肿瘤个体化治疗相关的肿瘤修复基因ＸＲＣＣ３，ＥＲＣＣ１和ＥＲＣＣ２作为检测的目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Ｔａｑｍａｎ－ＭＧＢ检测试剂系统，通过荧光实时定量ＰＣＲ方法，对肿瘤相关基因的特点位点突变进行检测，试剂系统是指包含本发明专利技术所涉及的任何特异性寡核苷酸序列和探针的实时荧光定量ＰＣＲ试剂系统。本发明专利技术可用于临床个体化用药方案的效果检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于检测
，具体涉及一种肿瘤修复基因突变的荧光实时PCR检测方法 及试剂系统。技术背景肿瘤是多因素疾病，许多因素可以引起细胞的DNA损伤。正常情况下，机体具有自我 修复损伤的能力。但如果这种修复能力下降则会引发肿瘤的产生。随着社会的发展和环境 的污染，以及吸烟率的增高，肺癌已经成为许多国家癌症死亡的首位原因。目前关于肺癌 的研究主要集中在基因修复方面。很多因素可以导致基因损伤，如，辐射，烷化剂等。对 于不同的损伤基因修复的方式也不同，同时，又有许多种修复基因参与基因的修复过程中。 DNA修复是对损伤的主要生物学反应，促使DNA中损伤的、不合适的或错配的碱基恢复本来 的生物化学过程，维持遗传物质的稳定。一基因修复的主要方式1 NER (核苷酸切除修复)主要修复累积性损伤，是人类最主要和最重要的DNA损伤修复方式。包括连续性损伤 的识别、染色质的重塑、在受损的DNA两端切开形成切口、切除受损的寡核苷酸、填补缺 口连接DNA链。此过程有30多个蛋白参与，包括的修复基因主要有ERCC1 (剪切修复交叉互 补组l)、 ERCC2(剪切修复交叉互补组2，亦称XPD)。吸烟导致的细胞DNA损伤主要通过NER 途径来修复。2 DSB (DNA双链断裂修复) DNA双链断裂主要由于复制错误或外源因素(离子辐射等)所致，由同源性重组和非同源性DNA末端连接完成修复。参与的修复基因中与肿瘤放射敏感性密切相关的基因主要有 XRCC3 (X线交叉互补组3)。大量研究已经证明，机体DNA修复能力的降低使机体发生各种肿瘤的风险大大增加。 DNA损伤修复能力的降低可能导致肺癌的形成。然而，降低的DNA修复能力却有利于铂-DNA 加合物持续的抗肿瘤活性。换句话说，增高的DNA修复能力会增加抗药性，这对于患者的 药物治疗方面是不利的。因此，在癌的易感性和对药物的抗性方面，DNA修复被认为是一 个"双刃刀"。人们研究还发现，基因的多态性的分布与种族差异而不同，且与肿瘤的形成 有关。人们又发现不同的基因型与治疗的预后也有关联。例如，XRCC3 Met241Met在预测用gem/cis治疗的年轻的NSCLC患者的生存方面是一个易于评估和有力的预测指标。综上所 述，基因的多态性不仅与肿瘤的形成和对药物的敏感性有关，还可以用来判断预后。临床 上可以根据患者不同的个体，制定最佳的治疗方案，从而做到个体化治疗。二实时荧光定量PCR试剂系统是由前端引物，后端引物，探针组成，与普通常规PCR 相比，有很高的特异性，敏感性高，通常达102拷贝/ml,其检测范围广，且重复性好，以CT 值为阈，能更精确的反映起始模板的拷贝数,可有效的解决模板污染的风险。T叫man探针检 测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM， TET， VIC， HEX等等。当探针完整的时候，由于 3'端的荧光淬灭基团在吸收5'端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧 光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬 灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher),本身不产生荧光，可以大大降 低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将 探针的Tm值提高10C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通T叫Man探针设计 得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱 基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富 含A/T的模板可以区分得更为理想。本专利技术基于以上技术原理，以ERCC1等肿瘤修复基因突变位点为目的基因，自主设计 一系列成套特异性寡核苷酸探针序列和引物序列，采用荧光实时定量PCR技术方法，用于 突变位点的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于创立一套用于肿瘤相关修复基因突变的荧光实时PCR检测方法及试 剂系统。本专利技术提出的肿瘤相关修复基因突变的PCR检测方法，是以肿瘤相关修复基因为检测的 目的基因，使用专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Taqman-MGB检测试 剂系统，通过荧光实时定量PCR方法，对肿瘤相关基因的特点位点突变进行检测。本专利技术中所述的的肿瘤相关基因是指ERCC1基因及其突变基因位点，ERCC2基因及其 突变基因位点，XRCC3基因及其突变基因位点。所述的特异性寡核苷酸探针序列和引物序列如下引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意表记方法或者修饰方法而 生成的寡核苷酸衍生物引物名称 寡核苷酸序列 针对ERCC1基因GGAATTACGTCGCCAAATTCC GCAATCCCGTACTGAAGTTCGTGAGACGGACGCCCACCT GGAGGCGGGAAAGGGACT CCCTCTCCCTTTCCTCTGTTCT CACTCAGAGCTGCTGAGCAATC或者:ERCC1-118FP ERCC1-118RP 针对ERCC2基因 ERCC2-312FP ERCC2-312RP ERCC2-751FP ERCC2-751RP 针对XRCC3基因 XRCC3-241FP XRCC3-241RP 探针至少包括下述-酸衍生物 探针名称 针对ERCC1基因 ERCC1-118FAM(C) ERCC1-118FAM(T) 针对ERCC2基因 ERCC2-312FAM(C) ERCC2-312FAM(T) ERCC2-751FAM(T) ERCC2-751層(G) 针对XRCC3基因XRCC3-241FAM(C) FAM-TCACGCAGCGTGGCCCCC-MGBXRCC3-241FAM(T) FAM-CACGCAGCATGGCCCCCAG-MGB 其中，FAM代表FAM基团(荧光素基团)，MGB代表MGB基团(淬光基因)，其中FAM可用其他任 意用于标记的荧光素替代，如HEX，TET等(1) 在ERCC1基因的片段SEQ.ID.N01中的突变位点(〉表示错配突变) ERCC1: 19007 C〉T(2) 在ERCC2基因的片段SEQ. ID.N02中的突变位点(〉表示错配突变) ERCC2: 23591 G〉A(3) 在ERCC2基因的片段SEQ.ID.N03中的突变位点(〉表示错配突变)ATGGCTCGCCTGGTGGT CCCTGCCTTGGTGCTCAC -种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷寡核苷酸及标记集团FAM-CAGGGCACGTTGCG-MGB FAM-CAGGGCACATTGC-MGB層-CTTCGTCGGGCAGCA-MGB FAM-TGCTGCCCAACGAA-MGB FAM-CTATCCTCTTCAGCGTCT-MGB FAM- CTATCCTCTGCAGCGTCT-MGB或者:ERCC2: 35931 A>C(4)在XRCC3基因的片段SEQ. ID.N04中的突变位点(〉表示错配突变) XRCC3: 18067 C〉T本专利技术所述Ta卿an-MGB荧光实时检测试剂系统是指包含有本方法所涉及的任何寡核 苷酸引物序列和探针序列的荧光实时定量P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肿瘤修复基因突变的实时ＰＣＲ检测方法，该方法以检测肿瘤修复基因为目的，使用针对肿瘤修复基因的专门设计的特异性寡核苷酸引物序列和水解探针，采用Ｔａｑｍａｎ－ＭＧＢ检测试剂系统，通过荧光实时定量ＰＣＲ方法，对肿瘤修复基因的特定位点进行检测；所述的肿瘤修复基因包括ＥＲＣＣ１，ＥＲＣＣ２，ＸＲＣＣ３基因；所述的特异性寡核苷酸引物序列至少包括下述之一种，以及由该引物序列采用任意表记方法或者修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：引物名称寡核苷酸序列ＥＲＣＣ１－１１８ＦＰＧＧＡＡＴＴＡＣＧＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＣＣＥＲＣＣ１－１１８ＲＰＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＥＲＣＣ２－３１２ＦＰＧＡＧＡＣＧＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＴＥＲＣＣ２－３１２ＲＰＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＥＲＣＣ２－７５１ＦＰＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＥＲＣＣ２－７５１ＲＰＣＡＣＴＣＡＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＸＲＣＣ３－２４１ＦＰＡＴＧＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＸＲＣＣ３－２４１ＲＰＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣ所述水解探针至少包括下述一种，以及由该探针采用任意标记方法或修饰方法而生成的寡核苷酸衍生物：探针名称寡核苷酸及标记集团ＥＲＣＣ１－１１８ＦＡＭ（Ｃ）ＦＡＭ－ＣＡＧＧＧＣＡＣＧＴＴＧＣＧ－ＭＧＢＥＲＣＣ１－１１８ＦＡＭ（Ｔ）ＦＡＭ－ＣＡＧＧＧＣＡＣＡＴＴＧＣ－ＭＧＢＥＲＣＣ２－３１２ＦＡＭ（Ｃ）ＦＡＭ－ＣＴＴＣＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡ－ＭＧＢＥＲＣＣ２－３１２ＦＡＭ（Ｔ）ＦＡＭ－ＴＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＡＡ－ＭＧＢＥＲＣＣ２－７５１ＦＡＭ（Ｔ）ＦＡＭ－ＣＴＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＣＧＴＣＴ－ＭＧＢＥＲＣＣ２－７５１ＦＡＭ（Ｇ）ＦＡＭ－ＣＴＡＴＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＴ－ＭＧＢＸＲＣＣ３－２４１ＦＡＭ（Ｃ）ＦＡＭ－ＴＣＡＣＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＣＣＣ－ＭＧＢＸＲＣＣ３－２４１ＦＡＭ（Ｔ）ＦＡＭ－ＣＡＣＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧ－ＭＧＢ其中，ＦＡＭ代表ＦＡＭ基团，ＭＧＢ代表ＭＧＢ基团；而且ＦＡＭ可用其他任意用于标记的荧光素替代；所述的Ｔａｑｍａｎ－ＭＧＢ检测试剂系统，由以下两部分构成：一：Ｔａｑｍａｎ－ＭＧＢ实时定量ＰＣＲ试剂系统：（１）５ＸＰＣＲ反应缓冲液：５０－２５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ.Ｃｌ（２０℃下ＰＨ８．３－８．８）１００－５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ０．５－２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ↓［２］２５ｍｍ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周彩存，张颉，张增利，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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