本发明专利技术提供了一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,包括磁微粒‑HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。本发明专利技术所述的试剂盒具有特异性好、灵敏度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒
本专利技术属于免疫分析医学
,尤其是涉及一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎是一种严重的传染性疾病,具有广泛性,给人们的健康带来了严重的危害,它主要是通过母婴、血液及性接触传播,是较常见的传染病之一。乙型肝炎病毒表面抗体(AntibodytoHepatitisBSurfaceAntigen,HBsAb,即抗-HBs),是一种由乙型肝炎病毒表面抗原(HepatitisBVirusSurfaceAntigen,HBsAg)诱导产生的特异性抗体。抗-HBs在血清中检出提示HBV感染后康复或接种乙肝疫苗后已有免疫力。急性乙型肝炎患者处于恢复期时,随着HBsAg的逐步消失,血清中出现抗-HBs,其为一种中和抗体,以HBsAg为疫苗免疫人体而产生,对HBV感染具有保护性免疫作用。酶联免疫吸附法(ELISA)因操作简单,无放射性污染,价格较低,被广泛应用,但其灵敏度较低。检测过程多采用手工操作,试剂或样本的加量不很精确,操作过程极为繁琐和复杂,检测结果的准确度和精密度较差。胶体金免疫层析技术(GICA):20世纪90年代初在免疫渗滤技术基础上建立的一种免疫学检测技术,快速方便,成本低廉,结果易于判读,但灵敏度过低。
技术实现思路
有鉴于此,本专利技术旨在提出一种灵敏度高、特异性好的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒。为达到上述目的,本专利技术的技术方案是这样实现的:一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。优选的,磁微粒-HBsAg重组抗原的工作浓度为0.1-2mg/mL、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的工作浓度为0.01-0.5μg/mL。优选的,所述磁微粒-HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤,取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液,加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒,室温搅拌40-60min,之后加入5-10mgHBsAg重组抗原,然后加入EDC,其浓度为5-10mg/mL,2-8℃反应1-1.5h后,用0.02-0.1mol/LTris缓冲液洗涤3次,最后用0.02-0.1mol/LTris缓冲液定溶至1L即可;优选的,磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁,粒径1-2μm。优选的,碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤,1)将待标记原料HBsAg重组抗原装入透析袋中,用0.02-0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液,透析30min;2)将经步骤1)处理的待标记原料HBsAg重组抗原与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合,之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h,期间换液2-3次;3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于4℃避光反应2h;4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01MPBS于4℃透析24h,加入等体积甘油,-20℃保存。优选的,活化的碱性磷酸酶的制备,包括如下步骤,1)配制2-15mg/mLALP溶液;2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液;3)将上述1)和2)配制溶液按体积比1:1混匀,室温避光反应30min;4)配制浓度为20-50μL/mL的乙二醇水溶液,与上述溶液3)以相同体积混合,常温避光反应30min,活化即完成,放-20℃保存。优选的,磁微粒-HBsAg重组抗原以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原中的HBsAg重组抗原均经过如下处理,1)二硫苏糖醇(DTT)用超纯水溶解,配制成0.5mol/L浓储,溶解后分装-20℃保存;2)HBsAg重组抗原中加入步骤1)配制的DTT浓储,至DTT终浓度为10-20mmol/L,室温避光反应20min;3)使用HBsAg重组抗原透析液透析HBsAg重组抗原2h。优选的,HBsAg重组抗原透析液的配制包括如下步骤,1)在600mL纯化水中,加入5-10gTris;2)再加入10-20gEDTA搅拌至完全溶解;3)加入1-5gNaCl,搅拌至完全溶解;4)再加入50-100mL的甘油,混合均匀;5)用纯化水定容至1L;6)用pH计测定其pH值,用6MHCl或2MNaOH调整pH值在8.0±0.2范围内的要求。优选的,步骤3)中,HBsAg重组抗原透析后,其中的DTT含量为1-5mmol/L。高浓度(≥10mmol/L)可以打开蛋白的二硫键,对抗体的特异性有益;低浓度的DTT(≤5mmol/L)可以保护蛋白,提高其稳定性。优选的,还包括化学发光底物液,其配制包括如下步骤,1)量取900mL的纯化水;2)向步骤1)的纯化水中分别添加0.1-0.5gAMPPD,0.05-0.1gNa2SO3,2-10gSDS(十二烷基硫酸钠),5-10gTris,搅拌至完全溶解;3)向步骤2)的溶液中分别添加0.02-0.1mLTween-20和1-3mLProclinTM300,定容至1L;4)调节pH至9.0±0.20,储存于2~8℃。磁微粒化学发光免疫分析(MCLIA)测定系统,该系统由免疫反应系统和化学发光系统组成,用免疫反应后的产物所产生化学发光信号来指示免疫反应物的存在与否及其含量的高低,以此达到对抗原或抗体物质含量的检测。MCLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法,具有灵敏度高、稳定性好、无污染等优点。本专利技术试剂盒采用双抗原夹心法检测人血清中的HBsAb。HBsAg重组抗原使用高浓度的二硫苏糖醇(DTT)对其进行预处理,处理完成后进行透析纯化,在特定透析液中透析2h,此时原料中DTT浓度降至1-5mmol/L。磁微粒直接连接处理后HBsAg重组抗原,碱性磷酸酶标记处理后的HBsAb重组抗原。反应管中加入磁微粒-HBsAg重组抗原及样本,再加入碱性磷酸酶标记处理后的HBsAg重组抗原,若样本中含有HBsAb,则与以上两种抗原形成夹心复合物,洗掉游离成分。加入化学发光底物液,碱性磷酸酶催化底物液发光,测定各样本管的发光值(RLU)。样本的发光值与其中的HBsAb呈正相关,从而定量检测人血清中的HBsAb含量。相对于现有技术,本专利技术所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,具有与进口试剂相当的灵敏度,且较低的检测成本。附图说明图1为本专利技术实施例中的试剂盒检测结果与雅培检测结果对照图。具体实施方式除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本专利技术所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本专利技术。一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,包括磁微粒-HBsAg本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。/n
【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:包括磁微粒-HBsAg重组抗原、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:磁微粒-HBsAg重组抗原的工作浓度为0.1-2mg/mL、以及碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的工作浓度为0.01-0.5μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:所述磁微粒-HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤,取100mL0.1-0.5M羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液,加入60-100mg表面联有氨基或羧基的磁性颗粒,室温搅拌40-60min,之后加入5-10mgHBsAg重组抗原,然后加入EDC,其浓度为5-10mg/mL,2-8℃反应1-1.5h后,用0.02-0.1mol/LTris缓冲液洗涤3次,最后用0.02-0.1mol/LTris缓冲液定溶至1L即可;优选的,磁微粒为表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁,粒径1-2μm。
4.根据权利要求1或2所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:碱性磷酸酶标记HBsAg重组抗原的制备包括如下步骤,
1)将待标记原料HBsAg重组抗原装入透析袋中,用0.02-0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液,透析30min;
2)将经步骤1)处理的待标记原料HBsAg重组抗原与活化的碱性磷酸酶按质量比1:(1-4)进行混合,之后用0.05M碳酸盐缓冲液于4℃透析16-24h,期间换液2-3次;
3)配制浓度为2-5mg/mL的NaBH4水溶液,按1mgALP加80μL配制好的NaBH4水溶液的比例进行混合,并于4℃避光反应2h;
4)将上述步骤3)完成的标记液用0.01MPBS于4℃透析24h,加入等体积甘油,-20℃保存。
5.根据权利要求4所述的乙型肝炎表面抗体检测试剂盒,其特征在于:活化的碱性磷酸酶的制备,包括如下步骤,
1)配制2-15mg/mLALP溶液;
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶...
【专利技术属性】
技术研发人员:张振斌,李华,史光辉,栾大伟,刘萍,
申请(专利权)人:博奥赛斯天津生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:天津;12
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