本发明专利技术提供一种用于检测、分离识别间充质干细胞的标记以及采用该标记检测、分离识别间充质干细胞的方法。序列表所示基因在间充质干细胞中特异表达。该基因构成作为检测间充质干细胞的标记。尤其是，本发明专利技术含有用于检测该间充质干细胞标记基因的探针，以及在检测该间充质干细胞基因标记时扩增被检细胞所述基因的ＰＣＲ所使用的引物，还含有本发明专利技术的间充质干细胞标记基因表达的多肽构成的用于检测间充质干细胞的多肽标记、用于检测该多肽标记的与该多肽标记特异结合的抗体，尤其是含有一种采用用于检测间充质干细胞标记基因的探针、与多肽标记特异结合的抗体对间充质干细胞进行识别、分离的方法。
【技术实现步骤摘要】
本申请是以下申请的分案申请原案申请号200480007550. 0 (国际申请号:PCT/JP2004/002457 ); 原案申i奮日2004年02月27日；原案专利技术创造名称 默领域本专利技术涉及^t测、分离i賜,^M干细胞、尤其是涉及在检测、分离识另,充质干细胞中 《柳的用于检测间充质干细胞的基因标己和多肽标记，以及用戶脱^H己检测、识别间充质干细 胞的方法。背景駄Mlf周知，间充质干细胞是存在于哺乳类的"t^处，分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细 胞的多能性干细胞。由于其分化的多能性，间充质干细胞作为以再生医疗为的目的多种组织的 移植材料正穀l汄们关注(《基因医学》第4巻第2期(2000)p58-61)。最近，发表了关于间充 质干细胞研究现状与展望的综述，作出了关于间充质干细胞的收集与培养的报告(实验医学、 第19巻第3期(2月号)2001、 p350-356)。此外，已有报道间充质干细胞也存在于脂肪 组织中(Tissue Engineering, P.A. Zuk et al.， Multilineage cells from human adipose tissue : implications for cell-based therapies. 7 : 211-228, 2001)。近年， 一些专利申请公开了关于间充质干细胞的培养、分化等内容。例如，特表 平11-506610号公报中公开了关于在无血清环境下维持人间充质前体细胞生存的组和 物及其方法，在特表平10-512756号公报中公开了关于为了诱导间充质干细胞的分化 将其与由前列腺素、抗坏血酸、胶原细胞外基质等组成的骨诱导因子、分化付随因子、 软骨诱导因子等生物活性因子相接触的方法，在特开2000-217576号公报中公开了关 于在催乳激素或其等效物共存下培养多能性间充质细胞，使间充质细胞分化成脂肪细 胞的方法。首先，本专利技术人公开了一种通过在基底膜细胞外基质存在条件下或是在含有成纤 维细胞增殖因子(FGF)等物质的培养基中培养间充质干细胞，使得间充质干细胞得以显 著的增殖，并且发现能够维持其分化能力，与以前的培养方法相比获得了效果显著的 间充质干细胞的培养方法(特开2003-52360号公报)。并且，公开了一种为了在采集间充质干细胞时在釆集母体以安全并且容易方式进行采集，从口腔组织中分离采集间充 质干细胞的方法(特开2003-52365号公报)。近年，随着再生医疗的进展，由于其分化多能性，人们正关注于将间充质干细胞 作为骨、软骨、肌肉、脂肪、齿周组织等多种组织的再生医疗性的移植材料。为了在组织的再生医疗中利用间充质细胞，首先，从活体组织中采集所述干细胞，使其增殖， 尤其是必需使其分化增殖，从而进行组织的制备。间充质干细胞存在于骨髓或骨膜中， 为了能在组织再生医疗中实现实用化，首先，必须要开发出能够安全地从所述组织中 采集间充质干细胞的方法。而且，为了间充质干细胞在组织再生医疗中实现实用化， 必须要开发出足以确保干细胞数量的技术。为了实现上述目的，重要的是开发出仍能 维持所采集的间充质干细胞的分化能力的培养增殖技术。通过上述内容，本专利技术人开发出一种实现在采集间充质干细胞时从采集母体中以 安全且容易的方式采集的分离采集的方法。尤其是，本专利技术人开发了一种通过在基底 膜细胞外基质存在条件下或是在含有成纤维细胞增殖因子(FGF)等物质的培养基中培 养间充质干细胞，以维持其的分化能力的形式大量增殖间充质干细胞的方法(特开 2003-52360号公報)。但是，为了使增殖培养的间充质干细胞在再生医疗中实用化，必 须确认所培养的细胞是间充质干细胞，必须开发出检测、识别该间充质干细胞的方法。 以前，在间充质干细胞中，无法对该细胞的特征标记基因进行鉴定。因此、为了使间 充质干细胞在再生医疗中实现实用化解决的重要课题是必须要开发出鉴定间充质干细 胞的标记基因，从而检测分离识别间充质干细胞的方法。本专利技术提供了用于检测识别间充质干细胞的间充质干细胞检测用基因标记和间 充质干细胞检测用多肽标记，用于检测该基因标记的PCR扩增用引物，以及采用该标 记和该引物检测、识别间充质干细胞的方法。本专利技术人为了发现检测间充质干细胞用 的标记基因，对间充质干细胞中的各种基因的表达进行了比较，对构成标记的基因进 行研究,结果发现，与序列表所示的13个基因相关的间充质干细胞与成纤维细胞之间的 表达量存在差异，间充质干细胞中特异表达，发现这些基因是间充质干细胞检测用的标记，从而完成本专利技术。本发 明含有用于检测该间充质干细胞标记基因的探针，和在检测该间充质干细胞标记基因 时用于扩增被检细胞的该基因子的PCR所用引物。此夕卜，本专利技术还含有本专利技术的间， 干细胞iH己基因,的多肽构成的用于检测间，干细胞的多助^H己、用于检测该多肽^i己的与该多助^i己特异结合的抗体。更，本专利技术含有一种采用用于检测间充质干细胞fei己基因的、与多月好斜己特异结合的抗体的间^M干细胞i賜'仿法和分离^法。TMX^^专利技术的aiii^fi兑明，在各种干细胞中，间^M干细胞在骨、软骨、肌肉、 月旨肪、#1#肌、心肌、血管、神经等许多组织中保持了分化能力，因此间充质干细胞作为再生 用细胞有很大前景。但是，迄今为战有^(寸间充质干细胞特征标己基因鉴定的描述。因此， 本专利技术人为了确定间颜干细胞的特征^i己基因，进行了积^itk研究。也就是，本专利技术人首次 开发，M31在FGF雜在下i歸间^M干细胞，翻僻隹持其分化能力的^I增殖方法，增殖 间顿干细胞，在FGF^^下培养由该力織得的间^M干细胞与A^纤维细胞，从培养细 胞中抽提mRNA，以该mRNA为模板，以DNA芯片(^ >廿^卜社insit公司)作为探针，通 过DNA微阵列法对人源间充质干细胞与成辦佳细胞中泰逸的基因进行比较。9400个基因中有63个基因在间，干细胞中显著高表达，141个基因显謝氏表达。其中 87个基因表达量差别达3倍以上(29个基因在间充质干细胞中高表达、58个基因低表达)。 iA^源于三个个体的间^M干细胞以^S^源于三个个体的成纤维细胞中抽ii^ RNA，以它们为 丰皿，M半定量的RT-PCR法对上述87个基因的表达量进行调査。其结果是大多数基因 的表达量未发现差异。此外，由于不同个体的间充质干细胞，或成纤维细胞之间也存 在表达量的差异，认为由个体差异引起表达差异的情形也是很多的。根据RT-PCR，经确认间充质干细胞中高表达的是3个基因(组织因子途径抑制剂 2(tissue factor pathway inhibitor 2)， 2类主要组织相容性复合体DR卩3(major histocompatibility complex class2DR beta 3),丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂)、经确 认低表达的基因有10种(基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease) 1, XV-a型胶原酶 (collagenase type XV alpha), CUG三联体重叠RNA结合蛋白(CUG triplet repeat RNA binding protein),皮肤桥蛋白，蛋白质酪氨酸激酶7(蛋白tyrosine激酶7),本文档来自技高网...
【技术保护点】
体外系统识别间充质干细胞的方法，其特征在于对被检细胞中编码蛋白质的间充质干细胞标记基因的表达进行检测，该间充质干细胞标记基因包括有以下基因中的一个或多个：人骨形态生成蛋白４（ＢＭＰ４），ＭＲＮＡ基因（ＮＭ＿００１２０２）；人克隆２４７７５ｍＲＮＡ序列基因／钾通道结构域１２（ＫＣＴＤ：ＡＡ４０２９８１）；基质Ｇｌａ蛋白（ＭＧＰ：ＢＦ６６８５７２）基因；蛋白聚糖１，分泌颗粒基因（ＰＲＧ１：ＡＶ７３４０１５）；种族同系物２（ＴＲＩＢ２：ＮＭ＿０２１６４３）基因；人动力蛋白，细胞质的，中间体多肽１（ＤＹＮＣ１Ｉ１），Ｍ（ＮＭ＿００４４１１）基因；脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ：Ｘ６０２０１）基因。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：加藤幸夫，辻纮一郎，小池千加，
申请(专利权)人：独立行政法人科学技术振兴机构，加藤幸夫，智再如股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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