通过耐酸性改造在昆虫中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法。本发明专利技术的在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣壳的方法，包括以下步骤：１）将改造后的Ｐ１２Ａ基因和口蹄疫病毒的非结构蛋白基因３Ｃ通过杆状病毒载体导入细菌内进行重组，得到重组杆状病毒Ａ；用重组杆状病毒Ａ的ＤＮＡ转染昆虫细胞，获得口蹄疫病毒空衣壳。本发明专利技术首次在昆虫细胞中组装成了完整的ＦＭＤＶ空衣壳，为基因工程亚单位疫苗和新型诊断试剂的研发奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。技术背景口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是偶蹄动物的一种急性烈性传染病，位 于A类动物传染病之首，世界各国均投入了巨额经费用于该病的防治。传统疫苗在 口蹄疫的防治中存在着不足，主要表现在疫苗使用的不安全性和难于进行感染动物 和免疫动物的鉴别诊断；同时在灭活疫苗的生产过程中，大量增殖自然病毒，需要 严格的防范病毒扩散的设施，尽管如此，仍然存在病毒逃逸和病毒灭活不完全而散 毒的可能性。2007-2008年英国口蹄疫的爆发就是因为病毒逃逸所致。口蹄疫病毒(FMDV)空衣壳具有与完整病毒相同的免疫学特性，但不存在散毒的风险，因而利 用各种表达系统生产FMDV的空衣壳一直是国内外研究的热点。FMDV衣壳呈二十面体对称结构，由60个相同的原体组成，每个原体由四种非 共价连接的蛋白组成，即VP4、 VP2、 VP3、 VP1。它们由氨基端至羧基端依次连接形 成P1聚蛋白。2A蛋白是FMDV的一个非结构蛋白，它的氨基端与P1聚蛋白的羧基 端连接形成融合蛋白P12A。在小RNA病毒科的所有病毒中，FMDV是对低pH值最敏感的。完整的FMDV在 pH值低于7的环境下，衣壳会解离成五聚体，它是由五个原体对称组装而成。在解 离过程中，RNA被释放出来，四条链中最小的一条链VP4就脱离原体。有资料表明 FMDV的酸不稳定性可能和五聚体一五聚体接触面上排列的组氨酸残基有关(Acharya R, Fry E, Stuart D I, et al. The three-dimersional structure of foot and mouth disease virus at 2.9A. Nature, 1989， 337: 709-716. Warwicker J. Model for the differential stabilities of rhinovirus and poliovirus to mild acidic pH based on electrostatics calculations. J. Mol. Biol. 1992,223: 247-257.) 。 Acharya等通过对一株 0型FMDV的3D结构分析表明，沿着一个原体的c90-A边缘排列的7个组氨酸残基(VP2上H21、 H65、 H87和H157; VP3上H141、 144和H191)离五聚体—五聚体接 触面很近，以使其能与相邻的五聚体上带电残基发生相互作用。由于组氨酸残基在 pH值低于7时带正电荷，这就使7个组氨酸残基和对面接触面上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸有可能产生静电推斥作用。但是在相同区域带负电荷的残基(谷氨酸、天门冬氨酸)会屏蔽这个效应。事实上，7个氨基酸中只有2个氨基酸(VP3上H141 和H144)所在位置上的组氨酸、赖氨酸和精氨酸残基的数目(5:2)大大超过了对 面五聚体一五聚体接触面10A范围内谷氨酸和天门冬氨酸的残基数。Twomey等人 对一株A型FMDV病毒分析发现，它也有7个组氨酸残基(其中有4个在0型上是 相同的)沿着五聚体一五聚体接触面以相同的位置排列(TwomeyT, France LL, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995， 206: 69-75.)。同样只有2个组氨酸残基(VP3上H141和H 144) 和其它位置上带正电荷的氨基酸的数目(6:2和6:3)大大超过了对面五聚体一五 聚体接触面IOA范围内带负电荷的氨基酸的数目。Curry和Twomey等确定了决定 酸不稳定性的五聚体间接触面上的氨基酸可能是H142和H145 (Twomey T, France L L, Hassard S, et al. Characterization of an acid-resistant mutant of foot-and-mouth cisease virus. Virology, 1995, 206: 69-75. Curry S, Fry E, Crowther J C， et al. Viral RNA modulates the acid sensitivity of foot-and-mouth disease virus capsids. J. Virol. 1995, 69: 430-438.)。在Asial型FMDV中，相对应的组氨酸在VP3上140位和143位。杆状病毒表达系统具有表达水平高、重组蛋白具有完整的生物学功能、能进行 翻译后的加工修饰和能同时表达多个基因等诸多优点，在重组蛋白的表达中广泛应 用。但是由于昆虫细胞的培养基pH值在6.3左右，因此很难应用杆状病毒表达系 统在昆虫细胞中组装稳定的FMDV空衣壳蛋白。Soo-JeongKye等用杆状病毒表达系 统在Sf9昆虫细胞中表达了 FMDV五聚体结构，电子显微镜下观察到的五聚体结构 比完整的FMDV粒子小得多(Jae-Ku Oema, Jong-Hyeon Park, Kwang-Nyeong Lee， et al. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine, 2007， 25: 4112-4121.)，这种五聚体结构是FMDV空衣壳组装过程中产生的 中间体，之所以没能成功地组成完整的空衣壳，主要原因可能是昆虫细胞培养基的 pH值影响了空衣壳的组装。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过耐酸性改造在昆虫细胞中组装口蹄疫病毒空衣 壳的方法及空衣壳蛋白和该空衣壳蛋白的用途。本专利技术所提供的口蹄疫病毒空衣壳蛋白，是将P12A进行耐酸性改造得到的突变蛋白，所述耐酸性改造是将P12A中VP3的自氨基末端第140-145位中的组氨酸 残基均突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸可为除精氨酸和赖氨酸外的其他17种氨基酸；优选亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、 丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选亮氨酸、异亮氨酸或缬氨 酸。所述P12A的VP4、 VP2、 VP3、 VP1和2A蛋白均可来自同一毒株，也可分别来 自不同的毒株。本专利技术也涉及改进口蹄疫病毒空衣壳的耐酸性稳定性。通过突变病毒衣壳五聚 体接触面的带正电荷的氨基酸为不带正电荷的氨基酸，有利地增加了空衣壳的酸性 稳定性。由现有的7个血清型(Asial、 0、 A、 C、 SAT1、 SAT2、 SAT3)的口蹄疫病毒P12A 蛋白进行耐酸性改造得到的耐酸性空衣壳蛋白mP12A，具体可为1) 其氨基酸序列为序列表中的序列2，它是由氨基酸序列是自GenBank Accession Number EF149009本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种空衣壳蛋白，是将口蹄疫病毒的Ｐ１２Ａ进行耐酸性改造得到的突变蛋白；所述耐酸性改造是将口蹄疫病毒的Ｐ１２Ａ中ＶＰ３的自氨基末端第１４０－１４５位中的组氨酸残基突变为酸性环境中不带正电荷的氨基酸；　　　　所述酸性环境中不带正电荷的氨基酸为天门冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；优选为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸或苯丙氨酸；更优选为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸；　　　　所述Ｐ１２Ａ的ＶＰ４、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１和２Ａ蛋白均来自口蹄疫病毒的同一毒株，或分别来自口蹄疫病毒的不同毒株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘在新，曹轶梅，卢曾军，孙普，李平花，郭建宏，谢庆阁，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]