一种重组人淀粉样蛋白Ａβ↓［４２］的制备方法及应用，属于融合蛋白技术领域。本发明专利技术根据人淀粉样蛋白前体蛋白ＡＰＰ的序列和克隆载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１多克隆位点，设计人淀粉样蛋白Ａβ↓［４２］的ＰＣＲ上游引物Ｐ↓［１］，引入ＢａｍＨＩ酶切位点，下游引物Ｐ↓［２］，引入ＳａｌＩ酶切位点及终止密码子ＴＡＧ。利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，以人ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，产物片断长度为１４７ｂｐ，编码人ＡＰＰ从６７２到７１３的Ａβ↓［４２］片段。将Ａβ↓［４２］基因片段序列重组于原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１，构建表达人Ａβ↓［４２］的原核表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］。将ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经诱导表达、分离和酶切，得到纯化的有活性的重组人淀粉样蛋白Ａβ↓［４２］。
【技术实现步骤摘要】
一种重组人淀粉样蛋白Ap^的制备方法及应用
一种重组人淀粉样蛋白A(342的制备方法及应用，本专利技术涉及一种重组人淀 粉样蛋白原核表达质粒的构建、表达及纯化方法，属于融合蛋白
技术背景阿尔兹海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种常发于老年人群的神经系统 慢性致残致死性疾病，专家们预言它将成为本世纪危害人类健康的第一杀手。 我国现有六百万痴呆病人，占全世界的四分之一，随着老龄人口的增加，每年 有一百万即每分钟有2个新增病例。因此，开展AD研究具有重大的社会和现 实意义。1984年Glenner首先从AD患者脑脊液中成功地分离出 一种相对分子质量约 为4.2kD的淀粉样肽，，并测定了其序列，由于其基本结构中含大量p片层，故 命名为P-淀粉样蛋白((3-amyloid, Ap)。 A卩是AD特异神经病理特征一老年斑 (Senile Plaques, SP)的主要成分。大量遗传学、病理学和生物化学研究表明，Af3 在脑组织中代谢平衡的破坏导致的聚集沉积，即从A(3单体到可溶性寡聚体，到 原纤维、纤维，最后形成SP的过程，是AD发生、发展的中心环节，是导致神 经元变性的重要因素，在AD的病理发展过程中起着成因性的作用。AP来源于(3-淀粉样蛋白前体蛋白((3-amyloid precursor protein, APP)， APP 经(3-及Y-分泌酶水解生成含有39 43个氨基酸组成的疏水肽段，很容易形成难 溶性沉淀，其中主要成分为A|342。当其发生聚集时，即可引起蛋白质和脂质等 生物大分子的氧化，最终引起神经元的变性。近年来，抑制Ap的聚集及降低其毒性效应已成为AD治疗的重要策略。A(3 抗体与Ap42肽、tan蛋白等联合检测可用于AD的早期辅助诊断。1999年， Schenk等用合成的AP42肽免疫APP转基因鼠，开创了 A|3疫苗治疗和预防AD 的新途径。由于A(342肽C末端33-42位氨基酸残基具有高度疏水性，以及28-42位残 基形成(3折叠构像，直接溶解于水溶液中的AP42肽溶解后立即聚集，形成不可 溶性的沉淀物，目前研究及临床中应用的AP通常是采用化学合成的高纯度的多 肽，随着合成肽链的增长，合成难度及费用增加，应用受到限制。
技术实现思路
.本专利技术的目的在于提供一种重组人淀粉样蛋白Ap42的制备方法及应用，提供能原核表达人淀粉样蛋白A(342的原核表达质粒pGEX-4T-l/AP42的构建方法，并将表达载体转化入BL21 (DE3)菌种,经诱导表达、纯化及酶切等得到有活性 的目的蛋白重组人Ap"蛋白。该蛋白可用于制备诊断和治疗老年痴呆相关疾病 的蛋白药物或相应疫苗中。本专利技术的技术方案 一种重组人淀粉样蛋白AP42的制备方法，步骤为步骤一原核表达质粒pGEX-4T-l/AI342的构建(1 )获得cDNA:提取人神经瘤母细胞SH-SY5Y总RNA，以oligo (dT) 为引物，反转合成获得SH-SY5Y细胞cDNA;(2) 引物设计及PCR:检索genbank,依据人淀粉样蛋白八|342的序列和载 体pGEX-4T-l的多克隆位点设计引物上游引物Pi: 5，陽CGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAG-3，， 引入万awHI酶切位点；下游引物P2: 5，陽ACGCGTCGACCTACGCTATGACAACACCGCCCA-3，， 引入酶切位点及终止密码子TAG;以人SH-SY5Y细胞cDNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度为147 bp， 扩增条件P/w DNA聚合酶，94 °C 30 s, 60 °C 30 s， 72 °C 1 min条件下扩增30 个循环；(3) 将上述(2)所得PCR产物及载体pGEX-4T-l进行&w/ZI和&/I双 酶切，经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用 T4连接酶连接，连接产物转化入CaCl2处理的新鲜制备的DH5a感受态菌中， 混匀后置冰中2分钟，37 。C培养l小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨 苄青霉素的固体LB培养基中，37。C培养过夜，挑取阳性单菌落克隆；(4) 提取阳性单菌落克隆中的质粒，经测序鉴定为重组的人淀粉样蛋白原 核表达质粒pGEX-4T-l/Ap42;将此重组质粒pGEX-4T-l/A(342转入DH5a菌株扩 增保种；并提取质粒pGEX-4T-l/AP42转入表达菌株五.co//BL21 (DE3)中，即成 A卩42的原核表达菌株pGEX-4T-l/A(342/BL21;步骤二 GST-A(3"融合蛋白的原核表达及纯化(5) GST-AI342融合蛋白的表达已构建好的pGEX-4T-l/A(342/BL21表达菌 株37 。C培养4 h，按1 : 100接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，25 。C 振摇培养至OD6oo为1.0 1.2，加入终浓度为1 mM的异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)， i秀导表达2小时，40,000 Xg离心15 min，收集菌体；95 。C煮沸5min, SDS-PAGE电泳，GST及Ap42抗体的Western blot分析证实表达菌中有GST-Ap42 融合蛋白表达；(6) GST-八|342融合蛋白的纯化每2克菌体以15 mL pH7.4、 50mM PBS 磷酸盐缓冲液重悬，冰上超声裂解，超声条件为超5s，停20s，共20分钟； 12,000 Xg离心20min，收集上清，挂Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱，经PBS磷酸盐缓冲液充分洗漆后，以10mM还原性谷胱甘肽溶液洗脱GST-A(342融合蛋白，收集洗脱液，即得到纯化的GST-Af342融合蛋白；(7) GST-Ap42融合蛋白的Western bloting鉴定将上述Glutathione Sepharose 4B亲和层析洗脱样品分别用抗A卩42及抗GST抗体进行Western bloting分析，证实该蛋白为GST-AJ342融合蛋白；步骤三八(342蛋白的酶切及鉴定(8) AP42蛋白酶切纯化纯化得到的GST-AP42融合蛋白经10U凝血酶/mg 融合蛋白，在pH7.4、 50mMPBS磷酸盐缓冲液体系中于23 °C反应16小时， 再依次经Glutathione Sepharose 4B亲和柱去除酶切下的GST蛋白，苯甲脒柱去 除凝血酶，得到纯的八(342蛋白；(9) A[342蛋白的Western bloting鉴定将上述(8)经酶切及双亲和纯化 得到的Ap42蛋白样品分别用抗Aj342及抗GST抗体进行Western bloting鉴定，结 果显示所得蛋白仅能与抗A卩42抗体反应，而不能与抗GST抗体反应，证实该蛋 白为A(3^蛋白；(10) AP^蛋白聚集分析利用能与淀粉样结构特异结合的荧光物质硫磺素 -T分析A(3"蛋白在体外聚集的性质，取30pM纯的A^2蛋白溶于pH 7.4、 50mM PBS磷酸盐缓冲液，取两个样本分别置于-20、 37'C孵育7天，孵育结束，各组 取3.6pL孵育液和120(iL用pH6.0、50mMPBS磷酸盐缓冲液新鲜配制的3.0 硫磺素-T溶液充本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人淀粉样蛋白Ａβ↓［４２］的制备方法，其特征在于步骤为： 步骤一：原核表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］的构建 （１）获得ｃＤＮＡ：提取人神经瘤母细胞ＳＨ－ＳＹ５Ｙ总ＲＮＡ，以ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，反转合成获得ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ｃＤＮＡ； （２）引物设计及ＰＣＲ：检索ｇｅｎｂａｎｋ，依据人淀粉样蛋白Ａβ↓［４２］的序列和载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１的多克隆位点设计引物： 上游引物Ｐ↓［１］：５’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＡＴＧＡＣＴＣＡＧ－３’，引入ＢａｍＨＩ酶切位点； 下游引物Ｐ↓［２］：５’－ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＣＧＣＴＡＴＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＣＡ－３’，引入ＳａｌＩ酶切位点及终止密码子ＴＡＧ； 以人ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，产物片断长度为１４７ｂｐ； （３）将上述（２）所得ＰＣＲ产物及载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１进行ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳割胶纯化回收酶切产物；将回收的目的片段和载体用Ｔ４连接酶连接，连接产物转化入ＣａＣｌ↓［２］处理的新鲜制备的ＤＨ５α感受态菌中，混匀后置冰中２分钟，３７℃培养１小时，室温离心弃上清，悬浮，平铺于含氨苄青霉素的固体ＬＢ培养基中，３７℃培养过夜，挑取阳性单菌落克隆； （４）提取阳性单菌落克隆中的质粒，经测序鉴定为重组的人淀粉样蛋白原核表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］；将此重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］转入ＤＨ５α菌株扩增保种；并提取质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］转入表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中，即成Ａβ↓［４２］的原核表达菌株ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］／ＢＬ２１； 步骤二：ＧＳＴ－Ａβ↓［４２］融合蛋白的原核表达及纯化 （５）ＧＳＴ－Ａβ↓［４２］融合蛋白的表达：已构建好的ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／Ａβ↓［４２］／ＢＬ２１表达菌株３７℃培养４ｈ，按１∶１００接种于含氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，２５℃振摇培养至ＯＤ↓［６００］为１．０～１．２，加入终浓度为１ｍＭ的异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷，诱导表达２小时，４０，０００×ｇ离心１５ｍｉｎ，收集菌体；９５℃煮沸５ｍｉｎ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，ＧＳＴ及Ａβ↓［４２］抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析证实表达菌中有ＧＳＴ－Ａβ↓［４２］融合蛋...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：俞惠新，张莉，谭成，陆春雄，林秀峰，陈波，宋翠翠，曹国宪，张荣军，黄群，徐希杰，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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