HBV非人动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种HBV非人动物模型的构建方法及其应用。包括：构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得位点特异性重组酶入核表达；第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，报告基因分为两段，分别与HBV基因的N端和C端融合，第二融和基因片段的两端还分别设置有位点特异性重组酶的识别位点，在位点特异性重组酶的作用下，第二融和基因片段能够环化，并使得报告基因的两段融合为完整的活性片段；当转基因动物体内注射诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。

【技术实现步骤摘要】
HBV非人动物模型的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种HBV非人动物模型的构建方法及其应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)是一种独特的具有逆转录过程的双链DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。其基因组全长约3.2kb，编码7个功能蛋白：HBV核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)、表面抗原(HBsAg)、聚合酶(pol)和X蛋白(HBx)。病毒在侵染宿主细胞的过程中，会把病毒核酸(RC-DNA)释放在胞质内，进一步在细胞核形成共价闭合环状DNA(cccDNA)或直接整合到宿主基因组中。其中cccDNA是以微染色体的形式存在，指导前基因组RNA(pre-genomicRNA)的合成，通过一系列的表观遗传调控，控制病毒的生命周期(Chenetal.,2015；SeegerandMason,2015)。现阶段的临床治疗通常采用核苷类似物(nucleot(s)ideanalogs，NAs)和干扰素(interferon，IFN)两种方式，尽管核苷类似物能有效抑制病毒的复制和逆转录过程，但不能清除HBV的慢性感染，主要原因在于共价闭合环状DNA(cccDNA)在肝细胞的长期稳定存在以及缺乏宿主对HBV的免疫应答。另外，对于HBV的研究主要集中在病毒的侵入(Infection)、复制(Replication)以及逆转录(ReverseTranscription)过程，而对于宿主与病毒在维持慢性感染的相互作用以及相应的免疫反应缺乏探索，主要是因为乙肝病毒狭隘的宿主感染范围和组织细胞嗜性，只能在少数的几种生物中感染复制。目前研究HBV的动物模型，主要分为非人灵长类动物、非灵长类动物和小鼠三大类。黑猩猩(Chimpanzee)和食蟹猴(MauritiusIsland，毛里求斯岛)是唯一支持HBV感染的非人灵长类动物。HBV感染黑猩猩人后主要表现为急性病毒肝炎，能诱导与乙型肝炎病人类似的病理和免疫反应，但不能建立慢性感染(LarkinJ，Science.1999)。在毛里求斯食蟹猴中，HBV可以建立慢性感染(DupinayT，Hepatology.2013)，但由于动物伦理的严格要求和成本考虑，非人灵长类动物用于生物医学研究受到限制。此外，树鼩是另一个支持HBV感染的非灵长类动物，其肝脏细胞具有HBV的受体Na+牛磺胆酸盐协同转运多肽(NTCP)(YanH，Elife.2012)。HBV可以在树鼩建立慢性感染，并诱发肝脏疾病发生。但是，非人灵长类和树鼩HBV动物模型在应用方面受到了许多限制，诸如：妊娠周期长、饲养成本高、资源缺乏等(BrezillonN，DisModelMech.2008)。而与之相比较更有优势的是，小鼠作为广泛应用的实验动物模型，具有易获得、经济、易饲养管理的特点，构建模拟HBV感染的小鼠动物模型成为HBV研究领域的重要内容。1995年，GuidottiLG等研究者构建了带有1.3倍HBV基因组长度(HBV1.3×)的转基因小鼠模型，可以产生高水平的HBV病毒(GuidottiLG,JVirol,1995)。但遗憾的是，该小鼠模型无法打破免疫耐受，不能诱导肝炎以及其他相关疾病，只能用于研究病毒的产生。1999年，zhang利用高压注射的体内转染技术构建水动高压力注射小鼠模型，通过从尾静脉快速注射大量裸质粒DNA，导致肝血管内静水压力升高，将使质粒DNA挤进肝细胞(ZhangG,HumGeneTher,1999)。该模型避免了基因组整合的问题，但所注射的质粒DNA中含有非HBV病毒基因组的质粒骨架，质粒骨架序列通常会引起较强的免疫反应，造成HBV质粒的快速清除(＜3周)，导致病毒持续时间较短。另外，高压注射效率低，只有5％～10％肝细胞含有HBV基因组，而且小鼠的个体差异较大，这些潜在的风险因素限制其在HBV研究领域的应用(YangPL,ProcNatlAcadSciUSA.2010)。随后，为了克服这些不利因素，AAV-HBV小鼠模型应运而生。腺相关病毒(AAV)结构简单，转染效率高，而且能够长期在宿主内稳定表达，最重要的是，AAV载体不表达任何AAV病毒蛋白，也不会引起宿主对AAV载体本身的免疫反应。2013年，DionS等报道了一种基于腺相关病毒血清型2/8(AAV2/8)的AAV-HBV感染小鼠模型(DionS,JVirol,2013)，结果显示，小鼠血清中HBsAg、HBeAg和HBVDNA病毒学指标可以持续1年以上，在肝脏中没有明显的炎症。但是，由于AAV载体存在特殊的ITR序列结构，这种结构可能是保持AAV载体在体内长期稳定的主要原因，而不是与HBVDNA有关(ZincarelliC,MolTher.2008)。因此，利用该模型得到的结果可能存在巨大的误导。不仅如此，上述各种小鼠模型均存在一个最大的缺陷：小鼠肝脏细胞中没有cccDNA的形成，导致模型只能研究HBV病毒蛋白与宿主因子的相互作用，不能反应真正的cccDNA生物学特征。而通过利用人肝细胞置换小鼠肝脏细胞所构建的肝脏人源化小鼠模型不仅支持HBV的感染，也有cccDNA的产生。2001年，Dandri和MercerDF等将正常人肝细胞移植到Alb-uPA/SCID小鼠中，构建了真正意义上的第一个人源化小鼠模型，该模型可以支持HBV感染，并能完成完整的生命周期(DandriM,Hepatology,2001；MercerDF,NatMed,2001)。但是，该模型的小鼠死亡率高，产率低，移植时间窗窄限制了其运用。2007年，AzumaH等利用乙酰水解酶(FAH)缺失导致的肝损伤构建了Fah-/-/SCID人源化小鼠模型，并在此基础上，构建了重组激活因子2(RAG2)、白介素受体γ(IL2Rγ)双缺失的Fah-/-/Rag-/-/IL2Rr-/-/SCID人源化小鼠模型，移植生存率可达到95％(AzumaH,NatBiotechnol,2007)。总的来说，上述人源化小鼠模型优势在于可以支持HBV的感染复制，并有cccDNA的产生，但遗憾的是都有相同的一个缺点，即存在免疫缺陷，导致该模型无法研究HBV与宿主免疫反应的相互作用关系，也限制了其在免疫病理机制和疫苗研制等方面的应用。而利用Cre-Loxp策略构建的HBVcccDNA小鼠模型则是一大技术进步，通过高压注射携带双Loxp位点的HBVcccDNA前体质粒DNA，在Cre重组酶的作用下形成只含有一个Loxp位点的环状cccDNA。2018年，LiG等利用Cre转基因小鼠，通过使用腺病毒载体(Ad)递送线性HBV基因组到小鼠肝脏内，通过Cre酶在肝脏细胞内进行重组得到HBVcccDNA。该小鼠模型中，HBV可以持续时长62周以上，并在小鼠肝脏中发现持续的坏死性炎症反应和纤维化。但是，该Cre-Loxp介导的cccDNA小鼠模型会因为细菌来源质粒DNA的强免疫原性、Cre的低效率和双向不间断重组，导致cccDNA体内的稳定性降低而被快速清除，而且HBV不能进行二次感染，不能模拟HBV感染的整个生命周期。因此，一种非本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HBV非人动物模型的构建方法，其特征在于，包括：/n构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：/n所述第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，所述诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得所述位点特异性重组酶入核表达；/n所述第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，所述报告基因分为两段，分别与所述HBV基因的N端和C端融合，所述第二融和基因片段的两端还分别设置有所述位点特异性重组酶的识别位点，在所述位点特异性重组酶的作用下，所述第二融和基因片段能够环化，并使得所述报告基因的两段融合为完整的活性片段；/n当所述转基因动物体内注射所述诱导剂时，能够产生HBV cccDNA。/n

【技术特征摘要】
1.HBV非人动物模型的构建方法，其特征在于，包括：
构建转入第一融和基因片段和第二融和基因片段的转基因动物，其中：
所述第一融和基因片段含有诱导型反应元件、启动子、入核信号以及位点特异性重组酶，所述诱导型反应元件能够在诱导剂存在的条件下使得所述位点特异性重组酶入核表达；
所述第二融和基因片段含有HBV基因和报告基因，所述报告基因分为两段，分别与所述HBV基因的N端和C端融合，所述第二融和基因片段的两端还分别设置有所述位点特异性重组酶的识别位点，在所述位点特异性重组酶的作用下，所述第二融和基因片段能够环化，并使得所述报告基因的两段融合为完整的活性片段；
当所述转基因动物体内注射所述诱导剂时，能够产生HBVcccDNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子为肝脏特异性启动子，优选为ALB启动子，其核苷酸序列优选如SEQIDNO:3所示。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述入核信号由一个或多个核定位信号提供，其核苷酸序列优选如SEQIDNO:4所示。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述位...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，冯成千，
申请(专利权)人：广州市第八人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44