ASGR1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用制造技术

本申请属于基因工程技术领域，公开了一种基因工程编辑位点以及获得的ASGR1突变基因在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用。通过对ASGR1基因序列中合适的编辑位点进行基因编辑，获得了传代稳定、易于诱导肝损伤的动物模型，并建立了稳定的繁育群体。本发明专利技术建立了一种获得传代稳定、易于诱导肝损伤的基因工程非人哺乳动物模型群体的方法，满足各种的实验需求。

【技术实现步骤摘要】
ASGR1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及ASGR1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用。
技术介绍
动物疾病模型是是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学(包括新药筛选)研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在实验动物伦理和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。肝损伤模型按成因可分为酒精肝损伤、药物性肝损伤、病毒性肝损伤。现有的制备技术主要有三类：1)外科手术制备。通过手术的方式，切除部分器官，造成器官损伤。由于动物个体间差异难以做到表型完全一致、手术操作及护理等问题限制了其应用。2)药物诱导。通过激素、化学试剂的方法造成动物，内循环受阻、脏器损伤。药物诱导产生模型较外科法有针对性，且种类范围更广，但是由于药物价格及剂量原因，在大动物上应用较少，且同样由于动物个体间差异，难以做到表型完全一致，无法满足规模制备和应用。3)基因编辑技术制备动物疾病模型。通过基因工程技术来制备疾病模型，与外科手术制备和药物诱导2种方法相比，基因编辑技术可以做到表型一致。但是基因编辑技术的关键在于需要筛选到合适的候选基因及编辑位点，且基因编辑动物尤其是疾病模型类的基因编辑动物的存活率低等限制了其发展。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基因工程编辑位点，用于高效制备易于诱导、可自然传代的非人哺乳动物肝损伤模型。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种ASGR1突变基因其为ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2840～2859位发生突变。突变是指生物体、病毒或染色体外DNA基因组核苷酸序列的改变。本专利技术所述突变包括一个或多个核苷酸的插入、缺少、替换。在本专利技术所述多个为2个、3个、4个、……146个、147个……156个。在本专利技术一些实施方案中，所述ASGR1突变基因为ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2840～2859位均发生20bp删除，命名为(-20bp/-20bp)突变型ASGR1突变基因。在本专利技术另一些实施方案中，所述ASGR1突变基因为ASGR1基因第5外显子上的一个等位基因第2817～2961位发生146bp删除，另一个等位基因第2852～2853位增加1bp，命名为(-146bp/+1bp)突变型ASGR1突变基因。去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)广泛表达在肝实质细胞表面，主要功能是清除血液循环系统中的糖蛋白、凋亡细胞以及脂蛋白等，其相关研究主要集中于靶向肝脏药物递送的应用及对于异种肝脏(细胞)移植术后产生的血小板减少性内出血。申请人模拟部分ASGR1基因突变人群对大动物进行基因ASGR1的编辑，获得易于诱导成不同类型肝损伤模型、且可以正常繁育的大动物群体。因此本专利技术还提供了所述ASGR1突变基因在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用。其中ASGR1突变基因其为ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2817～2961位发生突变。在一些实施方案中，所述ASGR1突变基因为(-20bp/-20bp)突变型或(-146bp/+1bp)突变型。在本专利技术中，所述哺乳动物为猪。在一些实施方案中，所述哺乳动物为巴马小型猪。在本专利技术中，所述肝损伤为酒精性肝损伤或药物性肝损伤。在一些实施方案中，所述药物性肝损伤为四氯化碳诱导肝损伤。进一步的，本专利技术还提供了哺乳动物肝损伤敏感模型的制备方法，采用基因编辑技术制备具有所述ASGR1突变基因的动物模型。在一些实施方案中，所述制备方法为采用基因编辑技术制备具有所述(-20bp/-20bp)突变型或(-146bp/+1bp)突变型的ASGR1突变基因的动物模型。在一些实施方案中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。本领域技术人员可以理解本专利技术所述制备方法并不限于采用第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9技术实现猪的基因组编辑，其它的基因组编辑技术也可以实现相同效果，包括锌指核酸内切酶(Zincfigernucleases，ZFNs)定向修饰靶基因编辑技术、类转录激活因子效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALENs)定向修饰靶基因编辑技术。进一步的，在一些实施方案中，所述的制备方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备所述ASGR1突变基因的动物模型的方法具体为在ASGR1基因第5外显子设计并合成特异识别靶序列DNA的sgRNA，构建含有sgRNA的表达载体用于细胞转染受体细胞，核移植制备动物胚胎，移植到发情的受体动物子宫内制备。在一些实施例中，所述sgRNA的序列如SEQIDNO:1所示，以制备获得ASGR1突变基因的动物模型。所述的合成的sgRNA寡聚核苷酸退火后连接表达载体。将构建好的表达载体测序验证连接正确后，提取质粒用于细胞转染。其中所述退火为94℃，10min；37℃，10min。在一些实施例中，所述表达载体为PX330表达载体。在本专利技术中，将猪耳成纤维细胞复苏，用含sgRNA表达质粒的电转液重悬后采用Lonza核转染仪按T-16程序进行电转染。并采用流式筛选可用于移植的克隆点。选取ASGR1敲除的克隆点用于核移植制备基因编辑动物胚胎并将其移植到发情的受体母猪子宫内获得ASGR1基因敲除猪。由上述技术方案可知，本专利技术提供了一种基因工程编辑位点以及获得的ASGR1突变基因在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用。通过对ASGR1基因序列的合适的编辑位点进行基因的编辑编辑获得的动物易于诱导成不同的肝损伤模型、且可以正常繁育，建立了稳定的繁育群体，满足规模化的使用需求，用于不同的实验。本专利技术还建立了一个获得易于诱导成不同肝损伤、可自然传代的基因工程非人哺乳动物模型群体的制备方法，可用于肝损伤模型的规模化制备。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1ASGR1基因sgRNA靶点设计示意图；图2示实施例1ASGR1基因敲除载体设计示意图；图3示实施例1ASGR1基因敲除猪基因型的鉴定；其中A为获得的ASGR1基因敲除巴马小型猪；B为PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ASGR1突变基因，其为ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2817～2961位发生突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种ASGR1突变基因，其为ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2817～2961位发生突变。


2.根据权利要求1所述的ASGR1突变基因，其为
(1)ASGR1基因第5外显子上的两个等位基因第2840～2859位均发生20bp删除；或
(2)ASGR1基因第5外显子上的一个等位基因第2817～2961位发生146bp删除，另一个等位基因第2852～2853位增加1bp。


3.权利要求1所述的ASGR1突变基因在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用。


4.根据权利要求3所述应用，所述哺乳动物为猪。


5.根据权利要求3所述应用，所述肝损伤为酒精性肝损伤或药物性肝损伤。


6.哺乳动物肝损伤...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘登科，邢向阳，
申请(专利权)人：成都中科奥格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51