一种DNA分子克隆方法技术

本发明专利技术提供了一种DNA分子克隆方法，所述方法包括：长引物的3’特异序列为核酸结合区，与模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；完整的长引物为核酸结合区，与第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增。本发明专利技术根据长引物的结构特点，通过调节退火温度将PCR扩增分为第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增，第一轮PCR扩增长引物3’特异序列作为有效结合区与模板结合，第二轮PCR扩增完整的长引物作为有效结合区与第一轮PCR扩增产物结合，通过两轮PCR扩增获得两端添加有附加序列的扩增产物，提高了长引物PCR扩增成功率和目的产物的得率。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA分子克隆方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种DNA分子克隆方法。
技术介绍
经典的分子克隆技术是基于限制性内切酶和DNA连接酶的，使用特定的内切酶切开载体/片段，携带互补末端的载体/片段在DNA连接酶的作用下相互连接，这种方法严格受限于酶切位点的数量、位置和种类。2009年，DanielGibson博士提出创新的分子克隆方法——Gibson组装，基于三种酶对带有同源末端的载体和插入片段进行体外修饰和连接，显著提高了分子克隆载体的构建速度和效率（Gibson,DanielG.,etal.2009）；另一方面，张友明教授等开发了RedE/T介导的同源重组技术，使用重组缺陷的大肠杆菌可控地表达催化同源重组的关键酶，摆脱了对酶切位点的依赖，使同源重组技术成为优于传统酶切连接的载体构建方法（Zhang,Y.,etal.1998）；2017年，张教授团队进一步拓展了RedE/T技术，提出了可用于功能和比较基因组学的ExoCET技术（Wang,H.,etal.2017）。目前，同源重组技术已经成为非常常用的分子克隆技术，借助加在DNA片段的两端附加同源臂序列，通过同源臂即可将片段重组到目标片段或载体上。DNA片段两端的同源臂可以通过传统的酶切连接方法进行添加，但是较难实现不增加额外序列的无缝拼接，且分子克隆耗时较长。目前商品化高保真DNA聚合酶种类繁多，且现有技术已经可以实现长引物（约200nt）合成，因此，可以直接将同源臂添加在待重组的DNA片段的PCR引物末端，通过PCR反应即获得携带有同源臂的扩增产物。与酶切连接方案相比，能显著节省时间和成本。但是，由于长引物通常包含较少的附加序列和较短的特异性序列，长单链易形成复杂的高级结构，采用长引物进行PCR时，扩增成功率和产物得率通常很低。CN105821067A公开了一种DNA分子克隆方法，该方法包括以下几步：1)长引物的PCR扩增。2)长引物参与的第二轮PCR扩增。3)PCR产物DpnI消化并转化到大肠杆菌感受态中。PCR产物的纯化可以显著的提高MP克隆的效率。实验证明，这种方法是一种简单有效的分子克隆工具。然而，该方法首先进行第一轮PCR合成长引物，再采用长引物进行第二轮PCR，第一轮未反应的引物和/或模板可能对第二轮PCR造成影响，导致PCR扩增成功率低、产生非特异性扩增产物等。巢式PCR主要用于扩增模板质量差、浓度低的体系，降落PCR主要用于扩增目的条带特异性差、杂带多的体系。常规引物通常为15~30nt，采用一步法PCR程序可以获得较好的扩增效果，但是对于长引物，一步法PCR扩增效率低，即使进行多次优化也仍然存在扩增失败的概率。因此，有必要提供一种新的长引物PCR扩增方法，提高载体构建效率。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种DNA分子克隆方法，所述方法通过调节退火温度将PCR扩增分为两轮PCR扩增反应，提高了长引物PCR扩增成功率和目的产物的得率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种长引物PCR扩增方法，所述方法包括：长引物的3’特异序列为核酸结合区，与模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；完整的长引物为核酸结合区，与第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；所述长引物从5’到3’依次包括附加序列和特异序列；所述长引物的附加序列的长度不小于35nt；所述长引物的长度不小于60nt；所述第一轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的3’特异序列Tm值和下游长引物的3’特异序列Tm值的较小值；所述第二轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的Tm值和下游长引物的Tm值的较小值；所述第二轮PCR扩增的退火温度不高于72℃。本专利技术中，由于长引物的长度显著大于常规引物的长度，与模板的结合及扩增过程复杂，因此根据长引物的结构特点，通过调节退火温度将PCR扩增分为第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增：第一轮PCR扩增根据长引物的3’特异序列的Tm值设置退火温度，将退火温度设置为上游长引物的3’特异序列Tm值和下游长引物的3’特异序列Tm值的较小值，在该退火温度下，3’特异序列可作为有效结合区与模板高效结合，有效降低了长引物的附加序列的空间位阻影响，PCR扩增获得适量的第一轮PCR扩增产物；第二轮PCR扩增根据完整的长引物的Tm值设置退火温度，将退火温度设置为上游长引物的Tm值和下游长引物的Tm值的较小值、且不高于72℃，在该退火温度下，完整的长引物作为有效结合区与第一轮PCR扩增产物高效结合，PCR扩增获得两端添加有附加序列的扩增产物，提高了长引物PCR扩增成功率和目的产物的得率。需要说明的是，完整的长引物的解链温度比3’特异序列的解链温度高，长单链DNA在较低温度的退火条件下易形成复杂结构，若按本领域技术人员所熟知的常规的PCR退火温度设置方法、将退火温度设置为低于Tm值3-5℃，容易出现非特异性结合，导致第一轮循环中产生非特异扩增产物，这类非特异扩增产物均包含了长引物的全长结合序列，在第二轮循环中也可作为扩增模板，导致最终产物中出现非特异扩增终产物。将第一轮退火温度设置为上游长引物的3’特异序列Tm值和下游长引物的3’特异序列Tm值的较小值，有效避免了这类非特异性扩增产物；第二轮亦以长引物的Tm值作为退火温度，相对第一轮的退火温度更高，在此退火温度下，仅全长的长引物能结合到第一轮PCR产物上进行扩增，可以有效地避免非特异扩增产物。本专利技术的方法显著提高了采用长度不小于60nt的长引物进行PCR扩增的成功率，成功率高达100%。本专利技术中，引物序列的Tm值采用最邻近法（Nearest-neighboralgorithm）计算确定。优选地，所述第一轮PCR扩增的退火温度小于所述第二轮PCR扩增的退火温度。本专利技术中，由于长引物的3’特异序列的长度小于完整的长引物，最适Tm值也小于完整的长引物的最适Tm值，因此可以将第一轮PCR扩增的退火温度设置为小于第二轮PCR扩增的退火温度，将长引物的3’特异序列作为第一轮PCR扩增的有效结合区，将完整的长引物作为第二轮PCR扩增的有效结合区，实现利用长引物的PCR扩增反应。本专利技术中，由于第一轮PCR扩增的退火温度与第二轮PCR扩增的退火温度差别较大，在第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增之间不需要对第一轮PCR扩增产物进行纯化步骤、而直接进入第二轮PCR扩增程序，有效避免了非特异性扩增条带的出现。本专利技术中，3’特异序列根据模板进行设计，5’附加序列为非模板特异序列即可。优选地，所述第一轮PCR扩增的变性温度与所述第二轮PCR扩增的变性温度相同。优选地，所述第一轮PCR扩增的变性时间与所述第二轮PCR扩增的变性时间相同。优选地，所述第一轮PCR扩增的退火时间与所述第二轮PCR扩增的退火时间相同。优选地，所述第一轮PCR扩增的延伸温度与所述第二轮PCR扩增的延伸温度相同。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA分子克隆方法，其特征在于，所述方法包括：/n长引物的3’特异序列为核酸结合区，与模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；/n完整的长引物为核酸结合区，与第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；/n所述长引物包括5’同源臂和3’特异序列；/n所述长引物包括SEQ ID NO: 1~2、SEQ ID NO: 3~4、SEQ ID NO: 5~6、SEQ ID NO: 7~8或SEQ ID NO: 9~10所示的核酸序列；/n所述第一轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的3’特异序列Tm值和下游长引物的3’特异序列Tm值的较小值；/n所述第二轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的Tm值和下游长引物的Tm值的较小值；/n所述第二轮PCR扩增的退火温度不高于72℃；/n所述第一轮PCR扩增的退火温度为54~57℃；/n所述第二轮PCR扩增的退火温度为65~72℃。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子克隆方法，其特征在于，所述方法包括：
长引物的3’特异序列为核酸结合区，与模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；
完整的长引物为核酸结合区，与第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增；
所述长引物包括5’同源臂和3’特异序列；
所述长引物包括SEQIDNO:1~2、SEQIDNO:3~4、SEQIDNO:5~6、SEQIDNO:7~8或SEQIDNO:9~10所示的核酸序列；
所述第一轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的3’特异序列Tm值和下游长引物的3’特异序列Tm值的较小值；
所述第二轮PCR扩增的退火温度取上游长引物的Tm值和下游长引物的Tm值的较小值；
所述第二轮PCR扩增的退火温度不高于72℃；
所述第一轮PCR扩增的退火温度为54~57℃；
所述第二轮PCR扩增的退火温度为65~72℃。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增和所述第二轮PCR扩增的变性温度为92~98℃。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增和所述第二轮PCR扩增的变性时间为10~30s。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增和所述第二轮PCR扩增的退火时间为10~30s。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增和所述第二轮PCR扩增的延伸温度为70~75℃。


6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增和所述第二轮PCR扩增的延伸时间为0.5~2min。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的循环数为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：琚存祥，张明坤，李松，
申请(专利权)人：江苏集萃药康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32