一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法技术

本发明专利技术公开了一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法。属于农业植物保护技术领域。包括如下步骤：菌株活化；孢子悬浮液的制备；团状菌丝体制备；原生质体的制备；原生质体的再生。与现有技术相比，本发明专利技术取得的有益效果为：提供了一种操作简单、重复性好、制备原生质体活力高的根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，原生质体的再生率达到了17.78％，为A.implicatum遗传转化体系的建立以及该菌生防机理的研究奠定良好的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法
本专利技术涉及农业植物保护
，更具体的说是涉及一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法。
技术介绍
根结线虫Meloidogynespp.是一类世界性分布的重要植物病原物，给全球农业生产带来了巨大的经济损失。根结线虫种类繁多，分布广泛，致病性强且寄主范围广泛、环境适应性强，能侵染几乎所有的蔬菜作物。在蔬菜作物中，以茄科、十字花科和葫芦科等危害最重。蔬菜作物被根结线虫侵染后会导致产量降低，品质下降。此外，根结线虫还会与其他的病原物形成复合侵染，造成更加严重的经济损失。根结线虫的防治主要为土壤熏蒸剂和化学杀虫剂，但是由于使用不规范、危害人类健康、污染环境等问题的频繁出现，越来越多的化学农药被禁止使用。寻找高效且环境友好的根结线虫防治措施是当前亟待解决的问题之一。因此应用微生物防治根结线虫已经成为国内外研究的重点内容。木霉Trichodermaspp.、拟青霉Paecilomycesspp.以及枝顶孢Acremoniumspp.等生防菌对根结线虫的防治效果显著。然而，对生防真菌防治线虫机制研究相对较少，限制了当前生物防治方法的应用。鉴于这种情况，需要加深对生防真菌防控机理的研究，而这项研究的关键技术就是建立生防菌的高效遗传转化体系。丝状真菌高效遗传转化体系的构建一般通过农杆菌介导或者聚乙二醇介导的原生质体转化实现。原生质体转化具有转化效率高、操作简单等特点，因此原生质体的制备是遗传转化的首要问题。由于真菌细胞壁组成和结构十分复杂，制备原生质体的体系和条件存在很大的差别。在原生质体制备过程中菌龄、渗透压稳定剂、裂解酶种类、酶解温度等条件均会影响酶解反应，造成原生质体制备条件差异大。由于结线虫生防真菌交枝顶孢细胞壁较厚，且孢子量较小且数量大，原生质体制备过程中制备团状菌丝体时很难将其去除。综上，如何提供一种操作简单、重复性好、制备原生质体活力高的根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，包括如下步骤：(1)菌株活化；(2)孢子悬浮液的制备：将活化后菌株接种到PDB培养基中，摇床培养后收集孢子并制备成孢子悬浮液；(3)将所述孢子悬浮液经过摇床培养、过滤得到菌丝体，之后将所述菌丝体用渗透压稳定剂反复冲洗至团状；(4)将团状菌丝体经崩溃酶driselase酶解后过滤，收集原生质体；(5)将所述原生质体使用固体再生培养基进行再生，培养条件为25℃～28℃黑暗培养3d。优选的，步骤(1)所述菌株活化：将在-80℃条件下保存的交枝顶孢菌株接种到PDA培养基，25℃～28℃条件下黑暗培养5d。-80℃保存的菌株活力降低，将其接种到PDA培养基上，28℃条件下黑暗培养5d，能够快速将菌株活化，保证菌株活力。优选的，步骤(2)所述摇床培养条件为25℃～28℃、150r/min培养2d。此条件下培养能够快速获得大量的孢子，制备孢子悬浮液。优选的，步骤(2)所述孢子悬浮液的浓度为1×108cfu/ml。孢子悬浮液浓度为1×108cfu/ml，在短时间内即可获得足够的幼嫩菌丝用于后续酶解步骤。优选的，步骤(3)所述摇床培养条件为25℃～28℃、150r/min培养36h～48h。此培养条件下获得的菌丝细胞壁薄，易于酶解制备原生质体。优选的，步骤(3)所述渗透压稳定剂为pH值6.5、浓度0.7mol/l的NaCl溶液。该渗透压稳定剂一方面可以维持根结线虫生防真菌交枝顶孢菌株制备的原生质体细胞内外渗透压平衡，另一方面保证崩溃酶driselase的酶解活性。优选的，步骤(4)所述崩溃酶driselase的浓度为20mg/ml，所述团状菌丝体与崩溃酶driselase的质量体积比为1:4g/ml。该质量体积比能够获得活力高、且较高数量的原生质体。优选的，步骤(4)所述酶解条件为28℃～30℃、120r/min酶解3h～4h。28℃崩溃酶driselase能够保持较高活性，温度太高或者太低均不利于酶活性的保持；适当增加酶解时间利于交枝顶孢原生质体的产生，但如果酶解时间过长，原生质体的产量降低，酶解3h为最佳酶解时间。优选的，步骤(5)所述固体再生培养基包括如下质量浓度的成分：0.1％酵母提取物、0.1％酶水解干酪素、1mol/l蔗糖和0.7％琼脂粉。该固体再生培养基能够保障原生质体再生所需的各种养分，琼脂粉浓度为0.7％，低于0.7％培养基难以凝固，大于0.7％培养基硬度变大，不利于原生质体穿透培养基再生。优选的，所述过滤均使用灭菌的三层擦镜纸进行过滤。三层擦镜纸空隙能够将根结线虫生防真菌交枝顶孢的孢子过滤；在原生质体制备过程中三层擦镜纸能够将原生质体和未充分酶解的菌丝过滤分离，得到原生质体溶液。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果为：本专利技术提供了一种操作简单、重复性好、制备原生质体活力高的根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，原生质体的再生率达到了17.78％，为A.implicatum遗传转化体系的建立以及该菌生防机理的研究奠定良好的基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为实施例3中裂解酶液A制备的原生质体；图2附图为实施例3中裂解酶液B制备的原生质体；图3附图为实施例5制备的原生质体及遗传转化菌株孢子和菌丝图，其中，a:原生质体(箭头所示)；b:激发光下转化菌株的分生孢子；c:激发光下转化菌株的菌丝，标尺＝10μm。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。实施例1(1)菌株活化：将-80℃保存的交枝顶孢菌株接种到PDA培养基上，28℃黑暗培养5d，对菌株进行活化；(2)孢子液制备：用5mm打孔器在步骤(1)培养的菌落边缘打孔，取一菌块置于PDB培养基中25℃，150r/min培养2d，收集孢子并制备成均匀的孢子悬浮液，浓度为1×108cfu/mL；(3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)菌株活化；/n(2)孢子悬浮液的制备：将活化后菌株接种到PDB培养基中，摇床培养后收集孢子并制备成孢子悬浮液；/n(3)将所述孢子悬浮液经过摇床培养、过滤得到菌丝体，之后将所述菌丝体用渗透压稳定剂反复冲洗至团状；/n(4)将团状菌丝体经崩溃酶driselase酶解后过滤，收集原生质体；/n(5)将所述原生质体使用固体再生培养基进行再生，培养条件为25℃～28℃黑暗培养3d。/n

【技术特征摘要】
1.一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化；
(2)孢子悬浮液的制备：将活化后菌株接种到PDB培养基中，摇床培养后收集孢子并制备成孢子悬浮液；
(3)将所述孢子悬浮液经过摇床培养、过滤得到菌丝体，之后将所述菌丝体用渗透压稳定剂反复冲洗至团状；
(4)将团状菌丝体经崩溃酶driselase酶解后过滤，收集原生质体；
(5)将所述原生质体使用固体再生培养基进行再生，培养条件为25℃～28℃黑暗培养3d。


2.如权利要求1所述的一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，其特征在于，步骤(1)所述菌株活化：将在-80℃条件下保存的交枝顶孢菌株接种到PDA培养基，25℃～28℃条件下黑暗培养5d。


3.如权利要求1所述的一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，其特征在于，步骤(2)所述摇床培养条件为25℃～28℃、150r/min培养2d。


4.如权利要求1所述的一种根结线虫生防真菌交枝顶孢原生质体制备与再生方法，其特征在于，步骤(2)所述孢子悬浮液的浓度为1×108cfu/ml。


5.如权利要求1所述的一种根结线虫生防真菌交枝...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚玉荣，郝永娟，霍建飞，贲海燕，刘晓琳，高苇，王万立，
申请(专利权)人：天津市植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12