真菌细胞壁合成基因制造技术

构建一种反映将ＧＰＩ－锚定蛋白质转运到细胞壁的过程的报告系统，并且公开了抑制该转运过程的化合物。此外，确定赋予上述化合物以耐受性的基因，并且揭示筛选化合物的方法，该化合物抑制由该基因编码的蛋白质的活性。因此，该新化合物提供了依据新机制的抗真菌剂，所述机制中，ＧＰＩ－锚定蛋白质转运到细胞壁的过程受到抑制。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码参与真菌细胞壁合成的蛋白质的DNA，由该DNA编码的蛋白质，检查某些化合物是否对GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运中所涉及的转运过程产生影响的方法，以及对GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运中所涉及的转运过程产生影响的抗真菌剂。
技术介绍
近年来，由于老人以及因高强度化疗等而导致的免疫受损患者的数目的增加，机会感染的管理变得比以往更重要。由假丝酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、隐球菌(Cryptococcus)等导致的深部真菌感染占这种机会感染的一部分，其比例正年复一年地增加。由众多无毒细菌导致的机会感染接连发生的事实表明，只要存在降低病人免疫功能的疾病，传染性疾病就不会终止。尽管在即将到来的老龄社会中传染病控制的策略(包括细菌耐药性的问题)将是至关紧要的问题之一，但是目前存在的有效治疗药物还相当少。 到目前为止，治疗真菌感染的药物的开发主要基于下列策略，即通过化学方法修饰已知的结构来制备新的化合物。但是，由于耐药性细菌的出现等问题，所以迫切需要开发基于新机理的新药物。 考虑到这种状况，本专利技术人瞄准了治疗药物种类不充分的抗真菌剂领域中的一种新途径。换言之，本专利技术人的工作集中在通过阻止病原体发挥致病性来影响感染的发作、发展和持续。为了避免感染的建立和发展，本专利技术人认为最有效的途径是抑制对宿主的粘附(这是感染建立的第一步)，以及随后的定居。另外，还实施了一种崭新的方法，即抑制粘附因子本身的表达。 为了抑制粘附因子的表达，本专利技术人将其注意力指向如下假设细胞壁糖蛋白如粘附因子首先通过GPI(糖基磷脂酰肌醇)-锚定在细胞膜上，然后再转运到细胞壁上(图1)。迄今，已经发现30或更多的细胞壁糖蛋白(包括粘附配体)是通过GPI-锚定转运的(称之为GPI-锚定蛋白质)。因此，专利技术人想到，如果该转运步骤受到抑制，则极有可能抑制粘附因子和构成细胞壁的主要蛋白质在细胞壁上的表达(Hamada K et al，Mol.Gen.Genet.，25853-59，1998)。已经报道过，GPI-锚定蛋白质存在于假丝酵母中，其为一种致病性的真菌(Kapteyn JC et al，Eur.J.Cell Biol.，65402-407，1994)。 本专利技术人开始了他们的研究，同时确信，抑制细胞壁合成的新抗真菌剂可以通过抑制真菌细胞膜中存在的GPI-锚定蛋白质转运到细胞壁的过程来制备。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发抗真菌剂，该抗真菌剂通过抑制细胞壁糖蛋白的表达，抑制细胞壁的装配及与细胞的粘附，以及阻止病原体表现出致病性，而体现出抵抗感染发作、发展和持续的作用。 为了筛选抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁之转运过程的化合物，本专利技术人制备了采用融合蛋白的报告系统，该融合蛋白包括报告酶和存在于CWP2(GPI-锚定蛋白质之一)的C-末端的转运信号(Van Der Vaat JM et al，J.Bacteriol.，1773104-3110，1995)。 构建包含分泌信号基因+报告酶基因+CWP2 C-末端基因(存在或缺失)的DNA，并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达融合蛋白，经证实，当CWP2C-末端存在时，可在细胞壁中检测到报告酶的活性；当CWP2C-末端不存在时，可在培养物上清液中检测到报告酶的活性。因此，可以预言，如果GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程受到试样的抑制，报告酶在细胞壁中的活性将会减少，或者报告酶的活性将会在培养物上清液中发现。因而，抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物的筛选是利用该报告系统开始的。 从采用该报告系统的筛选中发现了若干抑制GPI-锚定蛋白质到细胞壁的转运过程的化合物。有代表性的实例如式(Ia)所示的化合物。 前述式(Ia)所示的化合物(下文中称之为“化合物(Ia)”)抑制酿酒酵母和白色假丝酵母(Candida albicans)的生长，而且在前述化合物(Ia)存在下培养的白色假丝酵母表现出弱的粘附到细胞上的活性。这样，可以确定前述的化合物(Ia)适于本专利技术的最初目的，即基于对GPI-锚定蛋白质向细胞壁转运的系统的抑制，发现一种因为抑制真菌粘附素的表达而抑制真菌粘附的化合物。此外，通过透射电子显微镜观察可以证实，在前述化合物(Ia)的存在下培养的白色假丝酵母在其细胞壁合成中有异常。 本专利技术人证实，采用前述的化合物(Ia)可以制备基于抑制GPI-锚定蛋白质向细胞壁转运过程的机制的抗真菌剂。 此外，为了确定前述化合物(Ia)所作用的目标蛋白，本专利技术人检索了赋予前述化合物(Ia)以抗性的基因。 将酿酒酵母基因的质粒库引入酿酒酵母中，并通过过表达收集对前述化合物(Ia)表现出抗性的质粒。然后克隆抗性基因，测定核苷酸序列，并将该基因命名为GWT1(SEQ ID NO1)。在过表达GWT1基因产物的酿酒酵母中，具有GPI-锚定蛋白质之C-末端的前述报告酶转运到细胞壁上，即使在前述化合物(Ia)存在时也是如此。此外，通过透射电镜观察证实，即使存在前述的化合物(Ia)，细胞壁也是正常的。 而且，当将点突变随机地引入酿酒酵母染色体组的DNA上，并分离出对前述化合物(Ia)表现出特异抗性的突变菌株R1和R5时，在R1突变菌株中发现涉及GWT1基因第405号密码子自GTC变为ATC的点突变，以及在R5突变菌株中发现第140号密码子自GGG变为AGG的点突变。由于在这些突变的GWT1基因引入GWT1基因已被破坏的菌株时发现对前述化合物(Ia)的抗性，所以可以单独用GWT1基因来解释对该化合物的抗性。因此，这暗示前述化合物(Ia)直接作用于GWT1基因产物，以抑制GWT1蛋白的功能。 通过类似的方法，克隆白色假丝酵母的抗性基因(SEQ ID NO3和5)，测定核苷酸序列，并将该基因命名为CaGWT1。 此外，利用GWT1进行数据库同源检索，揭示了粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的同源物(SEQ ID NO27)。再者，基于酿酒酵母、粟酒裂殖唐酵母和白色假丝酵母的GWT1基因编码的蛋白质中高度保守区的序列设计引物，经PCR产生烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中的同源物(SEQ ID NO39和41)。而且，基于对GWT1的数据库同源检索发现的序列进行PCR，发现了新形隐球酵母(Cryptococcus neoformans)中的同源物(SEQ ID NO54和58)。 更具体地，本专利技术涉及下列内容。 1.一种编码蛋白质的DNA，当该DNA过量表达在真菌中时，所述蛋白质具有赋予真菌耐受式(Ia)所示化合物的活性，其中该DNA选自 (a)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA， (b)包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA， (c)在严谨条件下与包含SEQ ID NO1，3，5，27，39，41，54或58核苷酸序列的DNA杂交的DNA， (d)编码包含SEQ ID NO2，4，6，28，40或59氨基酸序列的蛋白质的DNA，所述氨基酸序列中，增加、缺失、取代和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码蛋白质的ＤＮＡ，当该ＤＮＡ过量表达在真菌中时，所述蛋白质具有赋予真菌耐受式（Ⅰａ）所示化合物的活性，其中该ＤＮＡ选自：　　　　（ａ）编码包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２，６，２８，４０或５９氨基酸序列的蛋白质的ＤＮＡ，　　　　（ｂ）包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１，５，２７，３９，４１，５４或５８核苷酸序列的ＤＮＡ，　　　　（ｃ）在严谨条件下与包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１，５，２７，３９，４１，５４或５８核苷酸序列的ＤＮＡ杂交的ＤＮＡ，　　　　（ｄ）编码蛋白质的ＤＮＡ，其中所述蛋白包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２，６，２８，４０或５９的氨基酸序列且增加、缺失、取代和／或插入一个或多个氨基酸，及　　　　（ｅ）利用ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２９和３１或者ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２９和３０为引物扩增的ＤＮＡ　　　　＊＊＊　　（Ⅰａ）。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：塚原克平，畑桂，相根康司，中本和孝，土谷满美子，渡边直彰，大场史记，塚田格，上田教博，田中圭悟，甲斐纯子，
申请(专利权)人：卫材RD管理有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]