一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于动物疫苗领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。该疫苗由PBD‑b‑PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述的PBD‑b‑PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1‑200：1。本发明专利技术提供的猪流行性腹泻病毒疫苗能够有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导抗体产生和细胞介导的反应；对怀孕母猪饲喂本发明专利技术的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法
本专利技术属于动物疫苗领域，具体地说，涉及一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）感染引起的一种急性、高度接触性的猪肠道传染病。PEDV可感染各年龄的猪，导致动物出现呕吐、水样腹泻及脱水等临床症状，以仔猪的感染最为严重，病死率可达80%-100%，给养猪业造成了巨大的经济损失。目前市场上预防猪流行性腹泻的疫苗多数为传统的肌肉注射疫苗，由于新生仔猪免疫系统发育不完善，注射疫苗不能及时产生保护力，导致免疫屡屡失败。通过给母猪免疫，在初乳中产生的母源抗体使新生仔猪获得被动型乳源性免疫力是目前预防新生仔猪肠道传染病理想的策略。如中国专利ZL201611000980.0公开了一种猪流行性腹泻病毒灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒和佐剂，其中佐剂是由以重量百分含量计5%角鲨烷、1%油酸、1%吐温80、92%0.005M柠檬酸钠缓冲溶液和1%的β-葡聚糖组成，所述猪流行性腹泻病毒是由猪流行性腹泻病毒毒株PEDV-KB2013-4株经灭活制备得到，其微生物保藏编号为CGMCCNo.12663；分类命名：猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）；保藏时间是2016年08月23日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。与现有的商品化疫苗毒株相比，本专利技术所筛选的猪流行性腹泻病毒PEDV-KB2013-4株具有免疫原性好，在产前42天前进行灭活疫苗的免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，能够有效抵抗强毒株的攻击，提高仔猪的存活率。然而在研究中发现，该疫苗在产前42天前对怀孕母猪进行注射后，虽然能够很快产生抗体，但在免疫后第2周抗体水平就呈明显的下降趋势，仔猪断奶后母源抗体水平逐渐消退，致使仔猪的抵抗力下降，不利于断奶后仔猪的保护。另外，该疫苗采用以角鲨烷、油酸和吐温80等制成的佐剂组分种类繁多，成分复杂，也给猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备带来了一定的难度。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒疫苗及其制备方法，其制备工艺简单，无需种类繁多的佐剂，且饲喂本专利技术的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其中，所述的猪流行性腹泻病毒疫苗由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1~200：1。蛋白是PEDV编码蛋白中的一种结构蛋白，它能把病毒粒子吸附在宿主细胞受体上，通过膜融合渗进细胞中。能诱导产生中和抗体，具有PEDV抗原的作用。本专利技术中，所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白可以为猪流行性腹泻病毒广东1株S蛋白，其基因序列记载在Genbank上（登录号为：KP698751）。本专利技术中，PBD-b-PEO/DOTAP形成一种结构、性质和尺寸均与正常细胞膜非常接近的双层脂质膜结构，它们是直径约为100nm的中空囊泡，且其壁是由双层的共聚物所形成的，能够在其壁中或中空结构内部掺入抗原，有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导抗体产生和细胞介导的反应，增强诱导产生抗体水平。经试验表明，通过给母猪饲喂本专利技术的由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成的猪流行性腹泻病毒疫苗，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并且母猪乳汁中的特异性SIgA水平能长时间维持一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，中和抗体水平逐渐增加，直到断奶后35天，仍保持较高的血清抗体水平，且较现有的疫苗相比抗体效价差异显著，从而给仔猪提供了更好的免疫保护。本专利技术中，PBD-b-PEO和阳离子脂质体DOTAP可从市场上购置得到，如PBD-b-PEO可购置于ACMBiolabs公司或加拿大PolymerSource公司；阳离子脂质体DOTAP可购置于ACMBiolabs公司（纯度大于99%）或加拿大TRC公司（纯度大于98%）。进一步的，所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白的浓度为5~100μg/ml。本专利技术还提供所述的猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法，其中，所述的制备方法包括如下步骤：1）将PBD-b-PEO和DOTAP溶于四氢呋喃溶液中，得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液；2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释，调节pH值至6.0~9.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；3）向猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液中加入步骤1）制得的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，搅拌，混合均匀，然后进行均化、除菌、包装，得到所述的猪流行性腹泻病毒疫苗。本专利技术制备工艺简单，无需种类繁多的佐剂；经对怀孕母猪饲喂本专利技术的猪流行性腹泻病毒疫苗后，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，使得所产仔猪在断奶后就能产生抗体，并在断奶后长时间维持在一个较高的血清抗体水平。进一步的，步骤1）中，PBD-b-PEO与DOTAP的质量比为10：1~20：1。进一步的，步骤2）中，所述的稀释为稀释至猪流行性腹泻病毒S蛋白浓度为5µg/ml~100µg/ml。进一步的，步骤3）中，PBD-b-PEO/DOTAP溶液与猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液的体积比为1：25~1：50。进一步的，所述的PBD-b-PEO/DOTAP溶液的加入速率为8~12µl/分钟。进一步的，步骤3）中，所述搅拌的搅拌速度为600~800转/分。本专利技术中，所述的缓冲液由如下组分配制而成：磷酸二氢钠12g蔗糖80g氢氧化钠适量盐酸适量甘氨酸0.7507g氯化钠0.2922g水加至1000ml与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：（1）本专利技术提供的猪流行性腹泻病毒疫苗能够有效地将抗原递送至抗原呈递细胞，并诱导强抗体和细胞介导的反应；（2）饲喂本专利技术的猪流行性腹泻病毒疫苗，可以显著提高母猪乳汁中的特异性SIgA水平，并且能使母猪乳汁中的特异性SIgA水平长时间维持在一个较高的水平，进而能通过乳汁被动地转移给新生仔猪，从而使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，提高仔猪的存活率、降低养殖损失；（3）饲喂本专利技术的猪流行性腹泻病毒疫苗的母猪所产仔猪在断奶后就能产生抗体，中和抗体水平逐渐增加，直到断奶后35天，仍保持较高的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒疫苗由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1~200：1。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒疫苗由PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白组成；所述PBD-b-PEO/DOTAP和猪流行性腹泻病毒S蛋白的质量比为100：1~200：1。


2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒疫苗，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒S蛋白的浓度为5~100μg/ml。


3.一种权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
1）将PBD-b-PEO和DOTAP溶于四氢呋喃溶液中，得到PBD-b-PEO/DOTAP溶液；
2）将猪流行性腹泻病毒S蛋白用缓冲液稀释，调节pH值至6.0~9.0，得到猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液；
3）向猪流行性腹泻病毒S蛋白溶液中加入步骤1）制得的PBD-b-PEO/DOTAP溶液，搅拌，混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮承迈，高辉，
申请(专利权)人：天津中逸安健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12