本发明专利技术涉及一种检测乙型肝炎引起的肝癌特征蛋白的优化质谱模型及其制备方法，属于质谱检测技术领域。本发明专利技术从血清中筛选出８个上调蛋白和３个下调蛋白作为特征蛋白，选取所述１１个蛋白中任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比ｍ／ｚ值及以该蛋白的临界峰值均值Ｍ，建立了乙型肝炎引起的肝癌患者与正常人、乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白质谱模型；本发明专利技术为进一步发现新的肝癌生物标志提供了基础。本发明专利技术对于肝癌的检测优于目前所采用的任何单一检测方法，为肝癌的早期发现、早期治疗提供了一种非侵入性技术，从而为降低肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率，并进一步为高危人群筛查肝癌提供了一种新方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于质谱检测
，特别涉及对肝癌血液优化的质谱检测方法。 一种通过 能与蛋白质结合的磁珠基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检测肝癌生物 标志。在此提及的此项专利技术涉及蛋白质检测领域，为一种新的非侵入性的体外质谱检测 方法。本专利技术可以应用到己经脱离人体的体液中的肝癌生物标志组合的检测方法或试剂
技术介绍
肝癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。肿瘤的发生、 发展是一个十分复杂和漫长的过程，伴随多基因和蛋白的分子改变。基因组学研究由于自 身的限制难以完全阐明基因与蛋白质参与过程及其具体作用。蛋白质组学高灵敏度的分析 技术有助于捕获那些在肿瘤演变过程中细微的分子变化，使之成为诊断和监测肿瘤演变的 重要线索。目前临床上对恶性肿瘤预后评估主要依赖于临床表现、病理学及传统肿瘤标志 (tumor marker),但肿瘤早期复发或转移时常常无明显临床表现，而病理学证据很难得 到且重复性差。中国目前有1.3亿乙型肝炎的携带者，其中包括2千3百万乙型肝炎引起 的肝硬化。肝细胞性肝癌主要由乙型肝炎导致的肝硬化引起。目前用于辅助诊断肝癌的 甲胎蛋白试剂盒的特异性与敏感性都很差，无法用于鉴别肝癌与肝硬化。肝癌的高死亡率 使得人们不断地寻求一种有效的早期检测方法，临床上仅以一种蛋白作为血清学检测指标 在敏感性和特异性上是远远不足的，而影象学检测一旦发现占位病变则已经不是很早期 了。能够使疾病在发生的极早期就能够得已发现，并得到控制和治疗，进而大大提高治愈 率或明显改善病人的预后和生活质量。近年来随着临床蛋白质组学的开展，使得肝癌的早 期发现成为可能。蛋白质的分离技术在蛋白质组学中应用分离技术有两个目的。第一、通过将蛋白质的 混合物分离成单一蛋白质或蛋白质小组以简化复杂的蛋白质混合物；第二、通过标记的方 法可以比较两个蛋白质的混合物样品中蛋白质的不同表现。其中主要的技术有双向电泳 (two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)、 高效液相层析(high-performance4liquid chromatography, HPLC)、毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)、亲禾口 层析(affinity choromatography)、蛋白芯片(protein microarray)、磁性微球(magnetic beads,简称磁珠)和免疫组等。特别是蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术克服 了以往技术的缺点，具有高灵敏度、高通量、结果重复性好、可机械化操作和方法灵活等 特点。待测样品来源广泛，不需作特殊前处理，可以直接点样检测，如血清、尿液及组织 液等；检测快速， 一般一例标本的检测时间仅需约5分钟，从标本制备到出结果全过程仅 约1小时。蛋白芯片和磁珠两项新的蛋白指纹图谱技术有可能在体液中潜在生物标志(biomarker)检测方面创造革命性突破(许洋，蛋白质指纹图谱技术在实验诊断与临床 医学中的研究进展，基础医学与临床，2007,27:134-142)。基质辅助激光解析/电离飞行 时间质谱 (matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass 印ectrometry， MALDI-T0F-MS)与蛋白芯片分离技术联合应用即为表面增强激光解析/电 离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption /ionization time of fight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)。 2-DE最先被用于临床蛋白组学研究，但其对疏水性、强 酸性和强硷性蛋白的分辩率不够，而且不能检测低丰度蛋白，故实用价值受限。近来，蛋 白芯片与质谱技术(SELDI-T0F-MS)的结合，已被成功地用于肿瘤研究；但由于磁珠表面 的结合面积远远大于蛋白芯片，从而磁珠的灵敏性比蛋白芯片更高(刘建栋等，血液蛋白 质组与质谱仪检测流程标准化初探。基础医学与临床，2007,27:193-197)。磁珠具有优于 二维电泳、蛋白芯片和其他质谱方法的特点，已被广泛地用于肿瘤生物标志的筛査等研究(屠世良等，癌胚抗原阴性结直肠癌的检测和结直肠癌预后相关生物标志，基础医学与临 床，2007)。该技术具有操作简便、无需离心样品、可直接分析原始生物样本(如血清、 尿液等)、样本用量小等特点，同时适合多样品平行检测和直接进行蛋白质全景式的搜索 和分析，特别是对小分子量蛋白和低丰度蛋白具有较高的捕获效果，可以与其他蛋白质组 学方法互补，目前已被广泛地用于肿瘤标志的筛查和临床检测，并均已获得很好的结果。 但国内迄今尚无采用磁珠与质谱技术获得检测正常及由乙型肝炎引起的肝硬化与肝癌血 清特征蛋白的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服对目前肝癌血清检测技术的不足之处，建立一种检测肝癌特征 蛋白的优化质谱模型及其制备方法和应用，该模型为早期检测提供了新的途径和方法，并 为进一步发现新的肿瘤生物标志提供了基础。本专利技术提出的检测肝癌血清蛋白质的质谱模型，其特征在于从血清中筛选出8个上 调蛋白和3个下调蛋白作为特征蛋白；选取上述11个特征蛋白中的任意两个或两个以上 的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比m/z值及以该蛋白的临界峰值均值M，建立了肝癌患者 与正常人、乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱 模型(图3-5)，所说的特异蛋白质质荷比m/z和临界峰值均值M分别为m/z-5080，M》8. 56; m/z=5810， M^10.56; m/z=5335， M》12.36; m/z=8690， M《2.87; tn/z=4470， M《20.21; m/z=11685， M《16. 04; m/z=5335， M》12.36; m/z=8937， M》10.71;分子量(m/z)误 差〈0.01%,临界峰值均值M的CV 〈 5 10%。本专利技术提出上述的检测肝癌血清蛋白质谱模型的制备方法，包括以下步骤1) 4"C条件下2小时内收集经病理明确诊断的肝癌及乙型肝炎引起的肝硬化患者血清 及经体检确定为正常健康者的血清作为两组血清标本，进行一8(TC低温冷冻备用；2) 采用WCX磁珠或C8及C18疏水基质磁珠对所述肝癌患者及正常人的两组血清标本 的蛋白进行吸附；3) 用激光解吸/电离飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337 nm)和80 cm或120 cm飞 行管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)对 结合在磁珠上的两组血清蛋白进行读取，设定最高检测分子量为50 kDa,优化分子量范 围1000 15000 Da，最佳聚集中心8000 Da，数据采集参数范围20 80，激光强度150-180， 检测敏感度为7-8，收集总数为130次，由此获得两组蛋白质谱图谱；4) 在每次实验数据收集前，用All-in-one标准蛋白及质谱的标准化质控0型血清校 正仪器，用2746 土 1 Da、 5909 土 1 Da、 6634 土 1 Da标准峰为质谱内标定性(分子量) 质控标准，使分子量本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测肝癌血清特征蛋白的质谱模型，其特征在于：从血清中筛选出８个上调蛋白和３个下调蛋白作为特征蛋白；选取上述１１个特征蛋白中的任意两个或两个以上的蛋白，根据各蛋白质峰的质荷比ｍ／ｚ值及以该蛋白的临界峰值均值Ｍ，建立了肝癌患者与正常人、乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌远端转移患者两两鉴别的血清特征蛋白检测质谱模型；其中肝癌患者与正常人鉴别的质谱模型Ａ由ｍ／ｚ＝５０８０，Ｍ≥８．５６；ｍ／ｚ＝５８１０，Ｍ≥１０．５６绘制而成，肝癌患者与乙型肝炎引起的肝硬化鉴别的质谱模型Ｂ由ｍ／ｚ＝５３３５，Ｍ≥１２．３６；ｍ／ｚ＝８６９０，Ｍ≤２．８７绘制而成，肝癌患者与乙型肝炎引起的肝硬化及肝癌远端转移鉴别的质谱模型Ｃ由ｍ／ｚ＝４４７０，Ｍ≤２０．２１；ｍ／ｚ＝１１６８５，Ｍ≤１６．０４；ｍ／ｚ＝５３３５，Ｍ≥１２．３６；ｍ／ｚ＝８９３７，Ｍ≥１０．７１绘制而成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许洋，高尚先，
申请(专利权)人：许洋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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