HIV蛋白酶活性测定指示剂、其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了一个新型的多肽荧光试剂，ＨＩＶ蛋白酶能大大增强该试剂的荧光强度。ＨＩＶ蛋白酶将内淬灭的多肽断开后产生更强的荧光产物，该产物在近红外区发出高强度的荧光信号。该产物的近红外荧光强度与ＨＩＶ蛋白酶活性量成正比。鉴于其荧光信号在近红外区，这种ＨＩＶ蛋白酶指示剂非常适合测定各种生物样品中蛋白酶的生物活性。本发明专利技术还提供了高通量筛选ＨＩＶ蛋白酶抑制剂的方法，这对研制治疗艾滋病新药时具有极大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新型的HIV蛋白酶活性测定指示剂及其制备方法，该 指示剂是一种多肽荧光试剂，HIV蛋白酶能大大增强该试剂的荧光强度。本 专利技术还涉及该指示剂的应用，所述的HIV蛋白酶指示剂可用于样品中蛋白 酶生物活性的测定，特别适用于各种生物样品中蛋白酶生物活性的测定，并 可用作HIV蛋白酶抑制剂的高通量筛选方法，这对研制治疗艾滋病新药具 有极大的应用价值。
技术介绍
在治疗获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者时，引入有效的具有特殊 HIV蛋白酶抑制剂功能的化合物，在临床上已获得很大的成功。研究表明， 人类免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的元凶。HIV蛋白酶的作用是催化裂解 HIV多肽中的gag和gag-pol，抑制该酶的活性会产生无感染能力的子代病 毒，从而阻止病毒进一步感染。因此HIV蛋白酶是抗艾滋病病毒药物的理 想耙点，HIV蛋白酶抑制剂可以降低甚至终止HIV蛋白酶的活性。目前经美国食品药品管理局(FDA)批准上市，用于治疗艾滋病患者的 HIV蛋白酶抑制剂有六种，amprenavir(安普那韦)，indinavir(茚地那韦), lopinavir(洛匹那韦)，nelfinavir(奈非那韦)，ritonavir(利托那韦)，禾口 saquinavir(沙奎那韦)。联合用药疗法(鸡尾酒疗法)是目前治疗艾滋病感染的基石， 其中就包括HIV蛋白酶抑制剂和HIV逆转录酶抑制剂。但是，并非所有的 艾滋病患者在进行鸡尾酒疗法时都能得到理想的效果，不同的患者对药物反 应变化很大。蛋白酶抑制剂和抗病毒性的关系已经被临床数据所证实；当鸡 尾酒疗法用于治疗患者时，潜在的药代动力学及药物之间的相互作用，既可 以提高也可能降低治疗效果。患者的配合程度直接影响药效，同样也就影响 治疗效果。因此，测定患者体内的HIV蛋白酶的浓度是非常必要的，以确保药物 在维持AIDS病人体内抗病毒活性方面是充分有效的；另外，生物样品中 HIV蛋白酶的定量测定对药物的研发至关重要。在治疗艾滋病其它重要的方面包括HIV蛋白酶代谢物的测定和抗HIV蛋白酶抗体的测定。HIV蛋白酶代谢物的测定可提供治疗效果方面的信息；抗HIV蛋白酶抗体则显示患 者被HIV感染，因此抗体的测定可用来诊断感染的可能性。定量测定在患者样品内HIV蛋白酶的经典方法是通过化验的方法，需 要复杂而昂贵的仪器，使临床分析变得非常困难。例如，用色谱的方法(HPLC 或者HPLC/MS/MS)分析血浆样品，可测定大量HIV蛋白酶的存在。(例如 Poirier， J. M. et al" Ther. Drug Monit. 22:465-473 (2000); Marzonlini, C., et al" J. Chromatogr. 740:43-58 (2000); and Remmel, R. P. et al" Clin. Chem. 46(1):73-81 (2000))。通常在血浆样品检测前进行了固相萃取，这样血浆没 有被直接分析而是进行了修饰，这种测定前的修饰增加了分析的复杂性并提 高了分析成本。放射性免疫测定通常在样品内含HIV蛋白酶类似物的放射标记物，与游 离的的HIV蛋白酶之间存在竞争。受体一般是特定HIV蛋白酶的抗体。据报 道在一放射性免疫测定的例子中，用I-125标记HIV蛋白酶的类似物，与病人 血浆样品中任何接有抗体的HIV蛋白酶存在竞争。沉淀出的抗体化合物通过 分析放射活性水平来测定HIV蛋白酶的浓度(例如Wiltshire, H. R. et al. Analyt.Biochem. 281:105-114 (2000))。在利用放射性免疫法间接测定，是将 HIV蛋白酶加入到含HIV蛋白酶培养基样品中，放射性标记抗体与分裂产物 发生特异性结合，通过测定放射性活度来测定培养基的分裂。如果分裂产物 不存在则意味着抗HIV蛋白酶抗体的存在(例如U.S.Pat. No. 5,171,662)。所有这些测定HIV蛋白酶抑制剂和他们代谢物的方法都取得了一定的 成功。但是，目前所有的HIV蛋白酶测定方法都存在测定速度慢，操作复杂 以及生物样品干扰太大的缺点。本专利技术则提供了一种简单快速测定的方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供了一种新型荧光测试试剂，在HIV蛋白酶存在 时它的荧光显著增强，因此可作为HIV蛋白酶活性测定指示剂，适用于快速 测定具有HIV蛋白酶活性的物质。本专利技术的荧光测试试剂被HIV蛋白酶消化后，在近红外区产生非常强的 荧光信号。鉴于他们的荧光信号在近红外区，这些HIV蛋白酶荧光底物非常适合测定各种生物样品(特别是冰冻切片)中HIV蛋白酶的活性。利用荧光 显微镜可以测定组织学样品以及流式细胞仪的悬浮样品。因此，本专利技术含荧光团的化合物HIV蛋白酶底物可以用来测定HIV蛋白酶活性和筛选HIV蛋白酶抑制剂。本文中，本专利技术的荧光测试试剂也称为荧光指示剂，或被称为HIV蛋 白酶荧光底物。本专利技术提供了一种荧光指示剂，该指示剂可增强HIV蛋白酶的荧光强度，并具有下述通式结构荧光淬灭团——多肽链——荧光发射团......................(I)其中所述的荧光淬灭剂是非荧光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶 氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶诱导水解；以及所述的荧光发射团是可 发射荧光的染料。优选的，上述通式中的荧光淬灭团的吸收波长大于600nm;以及其中 的荧光发射团的发射波长也大于600nm。 S卩，其中所述的荧光淬灭剂是最大 吸收波长大于600nm的非荧光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶氨基酸 的聚合物，可被HIV蛋白酶诱导水解；所述的荧光发射团是最大发射波长 大于600nm的染料。由于本专利技术的荧光测试试剂结构中采用了吸收波长和发射波长都位于 近红外区的发色团，使该试剂有最大的荧光共振能量转移效率。因此而完成 了本专利技术。例如，本专利技术说明书的附图1A和1B分别给出了可作为荧光淬 灭剂的Super Quencher 5TM和可作为荧光发射团的Cyanine 5的发射光谱。两 个光谱重叠得非常好，因而说明了两者之间具有最大的荧光共振能量转移效 率。本专利技术的荧光指示剂中，荧光淬灭团，多肽链和荧光发射团具有可调节 的多肽空间。所述的多肽是包含HIV蛋白酶结合点的氨基酸生物聚合物， 此结合点极易被HIV蛋白酶诱导水解；所述的HIV蛋白酶结合点提供的氨 基酸序列可以被HIV蛋白酶识别并切断，来显示HIV蛋白酶的水解活性。本专利技术荧光指示剂中的多肽链，即HIV蛋白酶结合点通常是由大约2 50个氨基酸的多肽组成，优选2 20个氨基酸，更优选2 10个氨基酸。 优选的，其中所述的多肽是选自以下片段HVSFNFPQITH ; Gaba-SQNYPIVQ; VSFNFPQITK;或SQNYPIVQK。本专利技术特别优选如下方程式II和III的荧光化合物作为荧光指示剂，其 荧光发射团的发射波长大于600nm，以及荧光淬灭剂团的吸收波长也大于 600nm:荧光淬灭团一HVSFNFPQITH—C (荧光发射团).............(II)荧光淬灭团一Gaba-SQNYPIVQ—荧光发射团 .................(III)以上方程式中的简写字母代表不同的标准氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光指示剂，该指示剂可增强ＨＩＶ蛋白酶的荧光强度，具有下述通式结构：　荧光淬灭剂－多肽链－荧光发射团…………………（Ⅰ）　其中所述的荧光淬灭剂是最大吸收波长大于６００ｎｍ的非荧光染料；所述的多肽链是含有ＨＩＶ蛋白酶氨基酸的聚合物，可被ＨＩＶ蛋白酶诱导水解；所述的荧光发射团是最大发射波长大于６００ｎｍ的荧光染料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜池敏，郑超斌，第五振军，
申请(专利权)人：北京泛博生物化学有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]