本发明专利技术公开了兔抗人ＩＲＧＭａ全长蛋白多克隆抗体的制备和应用，属中药单体干预疾病的领域。本发明专利技术选定全长ＩＲＧＭａ蛋白来制备抗体，包括了所有的功能区。在优选的基础上还提出了其制备方法，并根据引物设计原则设计引物，构建含ＩＲＧＭａ全长基因的Ｈｉｓ和ＧＳＴ融合蛋白来制备抗体。本发明专利技术所制备的抗体具有高度特异性和敏感性，有助于研究ＩＲＧＭ基因的表达谱分析及功能，并研究ＩＲＧＭ在ＭＳ发病过程中的具体作用，从而揭示ＭＳ的发病机制并寻找有效的基因免疫治疗措施。因此，人参皂甙Ｒｇ１有一定的干预多发性硬化的作用。本发明专利技术的人参皂甙Ｒｇ１可以明显降低多发性硬化的动物模型－ＥＡＥ小鼠的发病率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及IRGMa蛋白的制备和应用。具体的说是一种兔抗人IRGMa全长 蛋白多克隆抗体的制备和应用。
技术介绍
MS是T细胞介导的自身免疫病，研究发现临床表型严重者，IFN-y表达细 胞显著增多，提示IFN-y可使MS病变加重。小鼠Irgml (LRG-47)是由IFN-y诱导的蛋白，经研究发现Irgml与MS的动物模型EAE的发病机制有关。Irgml是IFN- y的一个下游效应子，对淋巴细胞的存活具有下游调节作用， 在免疫防御中起着重要作用。人类IRGM基因于2006年被克隆，定位于5q33.1， 编码一个氨基端和羧基端截短的G区。它与小鼠Ir柳同源，在人类吞噬细胞的 自体吞噬过程中是必要的，可以诱导BCG吞噬体的成熟。IRGM基因因3'端剪切方式不同，共有5个转录本，分别为IRGMa、 IRGMb、 :[RGMc、 IRGMd和IRGMe。 5个转录本的氨基酸数目分别为182、 211、 192、 199、 192。 IRGMa的182个氨基酸是5个转录本共有的，因此，IRGMa是该蛋白的主要功 能区。目前国外学者制备的IRGM抗体为C端涵盖10多个氨基酸外加一个半胱氨酸 (CQIRENVLENLQKER)的抗体，用免疫荧光或Western blot的方法，该抗体不能检测到细胞内源信号，由于其未包括主要功能区，限制了抗体使用的范围。而 目前没有商品化的IRGM抗体。因此，应用IRGMa全长蛋白制备兔抗人多克隆抗体， 并应用于研究IRGM基因的表达谱分析及在MS发病过程中具有实际作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是在IRGM基因中优选出一段编码序列，并制备出IRGMa全长 蛋白多克隆抗体及其应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是 一种兔抗人IRGMa全长蛋白 多克隆抗体的制备选用，其特征是针对IRGM蛋白的功能区，选用IRGMa来制 备抗体。选用哪一段蛋白来制备抗体及如何获得正确序列的蛋白是本专利技术的关 键。IRGM有5个转录本,5个转录本氨基酸数目分别为IRGMa(182) 、 IRGMb(211)、 IRGMc(192)、 IRGMd(199)、 IRGMe(192), IRGMa的182个氨基酸是5个转录本共 有的，因此，1-182氨基酸应该是该蛋白的主要功能区。而且，IRGMa为一个 外显子转录产物，IRGMb、 IRGMc、 IRGMd、 IRGMe为多个外显子转录产物，故用 IRGMa来制备抗体是既方便，又包括了主要功能区，因此是可行的。仅合成数十个氨基酸的多肽来制备兔抗人IRGMa多克隆抗体，可能导致抗 体特异性不够高；但如果针对IRGMa蛋白的功能区，直接通过合成多肽来合成 这么大片段且编码正确的蛋白十分昂贵，是不现实的。故本专利技术选择GST和His 基因融合蛋白的方法来制备该目的蛋白片段。表达GST和His基因融合蛋白， 必须构建含IRGMa全长基因(546bp)的GST和His基因融合载体；根据引物设 计原则设计引物。本专利技术的兔抗人IRGMa全长蛋白多克隆抗体的提取方法1、 从人的外周静脉血抽提基因组DNA。2、 引物设计及GST基因融合载体的选择选择了pCMV-迈yc， pGEX4T-2和 Pet-28a (O -His载体，并选用限制性内切酶EcoRI和Xhol做为连接点；根据 引物设计原则设计引物，做到同一条引物没有回文发夹结构，5'端与3'端的 4个碱基不互补，正反向引物序列不互补，Tm值相近(2A+2T+4G+4C),且在 Genebank上找不到同源系列；共设计了2对引物，序列如下第--对用于转载pCMViyc-IRGM和pGEX4T-2-IRGM载体IF: 5， -AgCgAATTCCTATggAAgCCATgMTgTTg-3，(含EcoRI切点)1R: 5， -gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切点)第二对用于转载pET-28a (+) -IRGM载体2F: 5， -AgCgAATTCATggAAgCCATgAATgTTg-3，(含EcoRl切点)2R: 5， -gCgCTCgAgTTAgTATTCACATACCCgCTC-3，(含XhoI切点)3、 制备目的基因片段并连接到myc， GST和His基因融合载体上以正常 人基因组DNA为模板，分别釆用上述3对引物和普通Taq酶扩增IRGMa全长编 码序列；应用TA克隆试剂盒将PCR产物分别连接到PCR2.1载体上，转化并挑 取阳性TA克隆，摇菌(大肠杆菌DH5ci菌株，上海卓康生物科技有限公司)，并 采用质粒抽提纯化试剂盒抽提纯化质粒；EcoRI和Xhol双酶切证实阳性TA克隆 并采用T载体引物及ABI PRISMR3700 DM序列分析仪测序鉴定连接在PCR2.1 载体上的目的基因片段序列的正确性；正确的TA克隆采用应用EcoRI和Xhol 双酶切，回收目的基因片段并连接到经过EcoRI和Xhol双酶切回收的myc, GST 和His基因融合载体pCMV-myc， pGEX4T-2 ， pET-28a (+) -His上并转化；抽 提质粒，测序验证。4、 含目的基因片段的GST和His基因融合载体的表达鉴定分别挑取1粒 转化好的GST和His基因融合载体克隆，用5ml 2YT培养基摇菌(大肠杆菌 origamiDE3， Novagen公司产品)，离心收集细菌并制备小量的GST和His基因 融合蛋白，采用PAGE-SDS胶电泳分离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示GST和 His基因融合蛋白片段大小。5、 制备并纯化GST基因融合蛋白及收集目的蛋白大量制备GST基因融 合蛋白，过柱纯化回收并定量，应用Thrombin 23X:酶切过夜，或GST基因融合 蛋白先挂GST珠子，用Thrombin 23'C酶切过夜，第二天过柱收集IRGMa全长目 的蛋白。6、 大量制备His基因融合蛋白因IRGMa-His基因融合蛋白为不可溶的蛋 白，故将离心收集的细菌用1 X蛋白上样Buffer裂解后采用PAGE-SDS胶电泳分 离蛋白片段，考马斯亮兰染色，显示His基因融合蛋白目的片段，割胶冻存于 -80'(:冰箱备用。7、 制备并纯化含GST-tag和His-tag的兔抗人IROIa全长蛋白多克蛰抗体:分别将由Thrombin酶切后回收的IRGMa蛋白和含His-IRGMa融合蛋白的PAGE 胶与不完全弗氏佐剂匀浆后皮下多点注射免疫家兔，1个月后从家兔的耳缘静脉取血lml，凝固后离心取血清，ELISA方法检测IRGMa多克隆抗体的滴度，此时 为l: 2000;此后每7-14天用不完全弗氏佐剂与蛋白匀浆后加强免疫1次，每 次注射前均从耳缘静脉取血lml, ELISA方法检测抗体滴度；加强免疫2次后， ELISA方法检测抗体的滴度达到了 1:10000以上；采用免疫印迹方法验证抗体的 特异性;从家兔颈动脉取血，离心收集抗体血清分装，采用Immobilized ProteinA Column (Pierce公司)纯化抗体，检测浓度并分装，保存于-80'C。 8、兔抗人IRGMa多克隆抗体的应用(1) 免疫印迹用pCMViyc-IRGMa转染的293T细胞，将收集的细胞裂解液 按不本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种兔抗人ＩＲＧＭａ全长蛋白多克隆抗体的制备选用，其特征是：针对ＩＲＧＭ蛋白的功能区，选用ＩＲＧＭａ来制备抗体；选择ＧＳＴ和Ｈｉｓ基因融合蛋白的方法来制备目的蛋白片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴志英，王柠，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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