本发明专利技术提供了一种检测链霉素的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被原的酶联板；酶标记物；链霉素特异性抗体；链霉素标准品溶液；底物显色液；终止液；浓缩洗涤液；浓缩复溶液。本发明专利技术还提供了一种检测动物源性食品中链霉素的方法，包括了以下步骤：样品前处理；用试剂盒的试剂进行检测；分析检测结果。本发明专利技术的目的是提供一种操作简便、费用低廉、适用于大量样本筛查的检测动物源性食品链霉素的酶联免疫试剂盒及检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测分析动物源性食品中兽药残留的技术，特别 是快速检测链霉素药物的酶联免疫试剂及方法。
技术介绍
链霉素(Streptomycin)是氨基糖苷类抗生素的一种，对革兰氏阴性 菌和部分革兰氏阳性菌特别是结核分枝杆菌具有显著的抗菌活性。链 霉素主要作用于细胞的核糖体，通过抑制细菌蛋白质的生物合成而呈 现杀菌作用。正是由于其独特的抗菌活性，所以自1943年首次在灰 色链球菌属中发现链霉素以来，它被广泛应用于多种疾病的治疗和 动物饲料添加剂，并在人、畜传染病的防治方面发挥了巨大作用。同 时，链霉素对人又有一定的、有时甚至是严重的毒副作用。链霉素引 起的主要毒副作用是耳毒性。因其能选择性地损害第8对脑神经，导 致前庭功能损害和耳蜗神经损害，严重时可造成永久性的耳聋。长期 使用还会使细菌产生耐药性,因此我国制定了食品中链霉素最高残留 限量，其中,牛奶中的链霉素残留限量为200|ig/L。链霉素目前一般采 用HPLC或LC/MS，但这类方法样本前处理及测定操作烦琐，检测 所需时间较长，检测费用高，推广使用受到限制。
技术实现思路
本专利技术的检测原理当包被原为链霉素偶联抗原时是将链霉素与鸡卵清白蛋白偶联物(Strep-OVA)吸附于固相载体上，加入样本或 链霉素标准品，然后加链霉素特异性抗体，待测样品中残留的链霉素 和酶标板上包被的链霉素抗原竞争链霉素特异性抗体。再加入酶标记 抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值， 该值与样品中链霉素残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出链霉 素的浓度。包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入链霉 素特异性抗体，再加入链霉素酶标记抗原和样本或链霉素标准品溶 液，待测样本中残留的链霉素和酶标记链霉素抗原竞争链霉素特异性 抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中链霉素残留 量呈负相关，与标准曲线比较即可得出链霉素的浓度，与标准溶液颜 色比较则可判断样品中链霉素的浓度范围。本专利技术提供了一种检测动物源性食品中链霉素的酶联免疫试剂盒，它含有(1) 包被链霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；(2) 酶标记物；(3) 链霉素特异性抗体；(4) 链霉素标准品溶液；(5) 底物显色液；(6) 终止液；(7) 浓縮洗涤液；(8) 浓縮复溶液。本专利技术所述试剂盒中链霉素包被抗原是采用碳二亚胺法将链霉 素半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到的，抗抗体可为羊 抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对 无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对 无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被链霉素抗原或抗抗体 的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、 交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、 微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1% 0.5% 吐温80， 0.5%叠氮化钠(NaN3)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭 液是含有8% 15%的脱脂奶和1%惰性蛋白的溶液。本专利技术所述试剂盒中包被链霉素抗原的酶联板或包被抗链霉素 抗体的酶联板的制备步骤为-(1) 用包被缓冲液将链霉素半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联 物或抗抗体以0.02~0.08pg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释 液；(2) 向酶联板的每孔中加入100^1已经稀释好的抗原稀释液或抗 抗体稀释液，37"C温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次 15 30s，拍干；(3)向酶联板的每孔中加入150 200nl封闭液，37。C温育1 2h， 倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试 验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。本专利技术所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记链霉素 抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本专利技术优选过氧化物酶； 酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50。/。甘油(可防止放入-2(TC环境的酶标记物冻结，亦可 长时间保持酶标记物的生物活性)、1%的叠氮化钠防腐剂(便于保存) 的溶液。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为 (l)抗抗体的制备以鼠源性抗体为免疫原对无病原体山羊进行 免疫，得到羊抗鼠抗抗体；或以兔源性抗体为免疫原对无病原、体山羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。(2)过氧化物酶标记抗抗体的制备将抗抗体与过氧化物酶 (HRP)进行偶联，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗体 与辣根过氧化物酶的结合率升高，传统GA —步法偶联反应不易控 制，反应速度快的分子易发生自生聚合，且偶联效率不高。为了解决 这些问题，我们将一步法进行了改进，克服了一步法的缺点。首先在 被偶联的两种分子中，与偶联剂反映较弱的分子先用过量的偶连剂活 化，然后去处多余的偶连剂；第二步将一端与某种分子连接的偶连剂， 通过改变反应条件而与另一种分子连接起来。二步法虽然操作较繁， 但偶连效率提高，而且形成的同分子聚合物减少。本专利技术所述试剂盒中酶标记抗原是采用活性脂法将标记酶与链 霉素半抗原进行偶联得到。本专利技术所述试剂盒中链霉素特异性抗体为鼠源单克隆抗体或兔 源多克隆抗体，免疫原是采用碳二亚胺法将链霉素半抗原与钥孔槭血 蓝蛋白进行偶联得到的；抗体形式可为冻干粉、浓縮液、工作液；抗 体稀释液为pH值8.2、 0.05mol/L、含有3%小牛血清和596oN,N，-二甲 基甲酰胺(DMF)的磷酸盐缓冲液。本专利技术所述试剂盒中链霉素特异性抗体可为单克隆抗体或多克 隆抗体，其制备方法如下(1)链霉素单克隆抗体制备的步骤为a. 动物免疫程序采用Balb/c小鼠作为免疫动物，免疫原(链霉 素半抗原与钥孔槭血蓝蛋白的偶联物)免疫剂量为80 100pg/只，首免 时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点 注射，间隔2 3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳 化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞；b. 细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5 10: 1 比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液， 筛选阳性孔，利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；C.细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液 制成l 5xl()S个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存， 复苏时取出冻存管，立即放入37X:水浴中速融，离心去除冻存液后， 移入培养瓶内培养；d. 单克隆抗体的制备与纯化采用体内诱生法，将Balb/c小鼠 (8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7~14天后腹腔注射杂交瘤细 胞5><105~106个/只，7 10天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行 腹水纯化，小瓶分装，-2(TC保存；e. 抗体冻干粉可将腹水在37"C环境下烘干，放入-2(TC保存；f. 抗体工作液是用抗体稀释液将抗体以0.02 0.08ng/ml浓度进 行稀释。(2)链霉素多克隆抗体制备的步骤为-采用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测动物源性食品中链霉素的酶联免疫试剂盒，它含有： （１）包被链霉素抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板； （２）酶标记物； （３）链霉素特异性抗体； （４）链霉素标准品溶液； （５）底物显色液； （６）终止液； （７）浓缩洗涤液； （８）浓缩复溶液； 其特征是：链霉素包被抗原采用碳二亚胺法将链霉素半抗原与鸡卵清白蛋白（ＯＶＡ）进行偶联得到，抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，特异性抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：聂继斌，唐俊，杨宏，温俊梅，齐欣，吴青，李成，杨宗繁，
申请(专利权)人：深圳市绿诗源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]
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