测定食品中苏丹红1号的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法技术

本发明专利技术公开了测定食品中苏丹红１号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法（ＥＬＩＳＡ），其特点是合成苏丹红１号的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原。通过杂交瘤技术包括免疫、融合、筛选等步骤获得抗苏丹红１号的单克隆抗体。该抗体用于苏丹红１号的免疫分析，标准曲线的浓度范围为０．１～１００ｎｇ／ｍＬ，ＩＣ↓［５０］为１．１～２．０ｎｇ／ｍＬ；抗体与苏丹红２－４号的交叉反应率为０．９５～３３．９％，与其他６种食品可添加色素几乎没有交叉反应；说明所建立的ＥＬＩＳＡ不仅灵敏度高而且特异性强。６种市售食品加标后用甲醇萃取，萃取液经适当稀释用ＥＬＩＳＡ测定，苏丹红１号的加标回收率为８８．２～１１０．５％，相对标准偏差为１．５～１７．４％。用ＨＰＬＣ和ＥＬＩＳＡ对９种加标样品进行分析，两种方法相关性较好（ｒ＝０．９８４０，ｎ＝９）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法 (ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。二
技术介绍
苏丹红属于一类人工合成的偶氮类化合物，为红色油溶性染料，主要用于石油、机 油和其他的一些工业溶剂中，目的是使其增色，也方用于鞋、地板等的增光。苏丹红染 料包括苏丹红l-4号四种物质，均含偶氮及萘的化合物结构，对人体的肝肾器官有明显 的毒性作用，具有致癌性。由于苏丹红价格低廉且不容易褪色，因此被一些不法商家用 于食品染色，对人体健康造成较大威胁。我国及其他许多国家都禁止将其用于食品生产。 2007年初，国家质检总局公布了辣椒粉、辣椒酱、油辣椒、豆瓣酱等预包装辣椒制品 和散装辣椒粉的产品质量调査结果，结果显示，不合格项目全部集中在苏丹红l-4号， 尤其是苏丹红l号。检测苏丹红的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，欧盟的标准方法(Eur叩ean Commission. NEWS notification: 03/99: Corrected method for the detection of Sudan.2005 ) 是将检测物经过乙腈萃取，过滤，滤液用高效液相色谱法分析，以波长可变的紫外-可 见光度检测器定性与定量，确证苏丹红可以使用液相色谱-电喷雾离子化质谱联用技术。 我国质检总局发布的国家标准(GB/T 19681-2005)，采用正相吸附和固相萃取原理， 对苏丹红染料用高效液相色谱进行了检测。目前，还报道了一些与高效液相色谱联用的 技术，均可以用于苏丹红的检测。但是色谱法仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测 成本高。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，常被 用于临床、药物、食品和环境等分析领域。本专利技术者以多克隆抗体为基础的测定食品中 苏丹红1号含量的酶联免疫吸附分析法已申请中国专利，200710049361.5,但多克隆抗 体存在一些不足，如与待测物的免疫亲和力不一致，抗体的总量有限，不能源源不断提 供性能相同的抗体等。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定食品中苏丹红1号含量的单 克隆抗体酶联免疫吸附分析方法，其特点是以单克隆抗体和抗原与抗体之间特异性反应 为基础而建立的分析方法。本专利技术的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。测定食品中苏丹红1号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法 (1)苏丹红l号修饰物的制备步骤1:将0.02~0.08 mol丙二酸溶于20~80 mL新蒸吡啶中，加入0.02-0.lmol对 硝基肉桂酸和0.001~0.004 mol醋酸胺，此混合物在温度100 150'C回流1~7小时，冷 却后，将反应物用醋酸重结晶，得到产物4 10g,熔程275~280°C;步骤2:将步骤1产物0.15 0.65g， 5-35mg钯碳，2~15mL甲醇加入反应釜中，通 入氢气，于温度100 120'C反应1 5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干 溶液，用二氯甲垸甲醇=5: l的体积比过柱，收集TLC板实验中Rf值为0.3的产物， 旋干溶液，得到乳白色固体；步骤3:将步骤2产物0. lg溶解在1.5 2.5 mL浓盐酸中，在温度5 1(TC加入含 0.01~0.06g亚硝酸钠的水溶液0.5 mL，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将 0.04 0.12g2-萘酚溶解于8 12n/。的氢氧化钠水溶液3 5mL中，冷却至5'C，再缓慢加入 重氮盐溶液，得到0.12 0.30g苏丹红l号-3-丙酸，简写为Sudan l-C3，其反应式如下<formula>formula see original document page 6</formula>(E)-3-(4-nitrophenyl)acrylic acid3-(4-aminophenyl)propanoic acid(2)免疫原和包被抗原的制备将0.10~0.45 mmol的Sudan l-C3， 0.10-0.80 mmol的二环己基碳二亚胺，0.10~0.80 mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，溶解于100~60(HiL的二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将 混合物离心5 20分钟，取上层清液，缓慢加入0.01~0.02%的牛血清白蛋白(BSA)或 卵清蛋白(OVA)，搅拌1 10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，Sudan 1-C3- BSA为免疫原，Sudan 1-C3- OVA为包被抗原；(3) 苏丹红1号单克隆抗体的制备免疫将免疫原溶解于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫 BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50-100吗，第一次免疫后，每隔两周再次免疫， 将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价， 最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；融合最后一次对小鼠加强免疫，三天后取脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 按5:1 10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培 养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于温度37'C， 5%0)2培养箱中培 养；筛选融合后2周，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明 确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；单克隆抗体的大量生产先腹腔注射液体石蜡于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种 杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，用硫酸 铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油1:1混合并置于温度-20'C 保存；(4) 建立基于单克隆抗体测定苏丹红1号的酶联免疫吸附分析方法(ELISA) 对所得单克隆抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定食品中苏丹红l号含量的ELISA。本专利技术的优点1. 对苏丹红1号的分子结进行合理修饰。2. 成功制备出抗苏丹红1号的单克隆抗体并建立测定食品中苏丹红1号含量的 ELISA。3. 灵敏度高、特异性强。4. 样品处理简单、测试量大、测试费用低。5. 对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。7四附图说明图l.为免疫原的紫外-可见光谱图a. BSA;b. Sudan 1号；c. Sudan I—C3—BSA由图1得知，在280nm(BSA) ， 320nm和492nm处(Sudan 1号)均有特征吸收，表明 苏丹红l号已成功与蛋白交联。 图2.为测定苏丹红1号的ELISA标准曲线由图2得知，9次ELISA测定的平均标准曲线，IC5。值(标准曲线中吸光度降低50% 所对应的苏丹红1号的浓度，IC5。值越小，灵敏度越高)为1. l~2.0ng/mL,检出限(LOD) 为0. 07~0. 14ng/mL.图3.为有机溶剂甲醇和乙腈对ELISA灵敏度(ICs。)的影响由图3得知，10%以下的乙腈和30%以下的甲醇对免疫测定影响较小，表明抗体对 有机溶剂的耐受性较好。图4.为ELISA和HPLC对9个加标样品中苏丹红1号的检测结果的相关曲线由图4得知，两种方法相关性较好，回归方程为Y=0.8492X+0.3525 (r=0本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定食品中苏丹红１号含量的单克隆抗体酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤：　（１）苏丹红１号修饰物的制备　步骤１：将０．０２～０．０８ｍｏｌ丙二酸溶于２０～８０ｍＬ新蒸吡啶中，加入０．０２～０．１ｍｏｌ对硝基肉桂酸和０．００１～０．００４ｍｏｌ醋酸胺，此混合物在温度１００～１５０℃回流１～７小时，冷却后，将反应物用醋酸重结晶，得到步骤１产物４～１０ｇ，熔程：２７５～２８０℃；　步骤２：将步骤１产物０．１５～０．６５ｇ，５～３５ｍｇ钯碳，２～１５ｍＬ甲醇加入反应釜中，通入氢气，于温度１００～１２０℃反应１～５小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，用二氯甲烷∶甲醇＝５∶１的体积比过柱，收集ＴＬＣ板实验中Ｒｆ值为０．３的产物，旋干溶液，得到乳白色固体；　步骤３：将步骤２产物０．１ｇ溶解在１．５～２．５ｍＬ浓盐酸中，在温度５～１０℃加入含０．０１～０．０６ｇ亚硝酸钠的水溶液０．５ｍＬ，搅拌数分钟，得到淡黄色重氮盐溶液，将０．０４～０．１２ｇ　２－萘酚溶解于８～１２％的氢氧化钠水溶液３～５ｍＬ中，冷却至５℃，再缓慢加入重氮盐溶液中，得到０．１２～０．３０ｇ苏丹红１号－３－丙酸，简写为Ｓｕｄａｎ　１－Ｃ３，其反应式如下：　＊＊＊　（Ｅ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　３－（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　＊＊＊　ＳｕｄａｎⅠ－３－ｐｒｏｐａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　（２）免疫原和包被抗原的制备　将０．１０～０．４５ｍｍｏｌ的Ｓｕｄａｎ　１－Ｃ３，０．１０～０．８０ｍｍｏｌ的二环己基碳二亚胺，０．１０～０．８０ｍｍｏｌ的Ｎ－羟基琥珀酰亚胺，溶解于１００～６００μＬ的二甲基甲酰胺，室温搅拌过夜，将混合物离心５～２０分钟，取上层清液，缓慢加入０．０１～０．０２％的牛血清白蛋白或卵清蛋白，搅拌１～１０小时，离心分离，取上层清液，透析数天，其中，Ｓｕｄａｎ　１－Ｃ３－牛血清白蛋白为免疫原，Ｓｕｄａｎ　１－Ｃ３－卵清蛋白为包被抗原；　（３）苏丹红１号单克隆抗体的制备　免疫：将免疫原溶解于生理盐水中，再与等体积的完全福氏佐剂混合，皮下多点免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，每只小鼠免疫原剂量在５０～１００μｇ，第一次免疫后，每隔两周再次免疫，将完全福氏佐剂换成不完全福氏佐剂，第三次免疫后一周，尾部取血测鼠的抗血清效价，最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；　融合：最后一次对小鼠加强...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓安平，王玉珍，杨红，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]