一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系制造技术

本发明专利技术涉及一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系测定氯霉素残留量的方法，是通过制备特异性强的抗－ＣＡＰ单克隆抗体（简称单抗）制备出抗ＣＡＰ单抗与磁珠的复合物（免疫磁珠），利用该免疫磁珠吸附样品中的ＣＡＰ，再通过磁性分离技术将吸附ＣＡＰ的免疫磁珠与上清分离，然后再用乙酸乙酯抽提免疫磁珠吸附的ＣＡＰ，从而达到ＣＡＰ的富集浓缩目的，然后再将此富集浓缩的ＣＡＰ样品经直接竞争抑制ＥＬＩＳＡ方法进行检测。采用此方法检测氯霉素稳定性好，同时提高了检测的灵敏度，其极限值达到了０．００２ｎｇ／ｍＬ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种磁性分离技术和酶联免疫检测技术，具体的说是一种利用磁 珠标记配合酶联免疫检测方法对待检样品中氯霉素残留量进行测定的方法。 背景知识氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素，对 革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用。由于其优良的抗菌性、稳定的药性 和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用与人和动物临 床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素 具有毒性，CAP在动物性食品中的残留直接危害着人们的健康和生命安全。特别 是人体接触后后果严重，能产生再生障碍性贫血、其他恶性血液病等毒副作用， 对人类的健康构成巨大的潜在威胁。美国最早规定不允许在家禽饲养中使用CAP， 出售的家禽必须做CAP残留检测。鉴于健康原因，联合国粮农组织(FAO)、世界 卫生组织(WHO)和许多国家规定禁止将CAP用于食品动物，中国同样已经禁止使 用CAP，并且规定CAP的检测限量值牛奶0.25ng/mL、肉类1. 5ng/g、尿液 1. 0ng/mL、血清0. 5ng/mL、蜂蜜(快检)1. 5ng/g、蜂蜜(C18柱)0. lng/g，并且我 国农牧发24号文同样规定，在马肝、鸡肉、真鲷肌肉中的氯霉素残留限量 为不得检出；欧盟的进口食品卫生标准同样规定氯霉素含量标准为不得检出；目 前美国食品及药物管理局(FDA)和芬兰进一步规定CAP的最高残留限量(RML)为 0，即不得检出，但是各种CAP的检测方法都有检测极限，不能达到0。目前CAP的检测方法很多。其中气相色谱法和液相色谱法，灵敏度高，其检 测极限可以达到0.7ng/mL，但样品前处理过程相对复杂，仪器化程度高且价格 昂贵，分析速度慢，不适合在基层推广使用及大量样本筛选；微生物法经济、简 单，但灵敏度有限，且缺乏特异性；放射免疫分析法适用于肉蛋奶，检测限约为 200ng/kg，但具有同位素半衰期短，存在放射性污染等缺点。而ELISA方法具有 灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于现场 监控和大量样本筛选。据目前文献报道，常规的ELISA检测极限是0. lng/mL。 但是，随着人们对健康状况要求的不断提高，CAP的最高残留限量(RML)同样也 将会跟美国和芬兰一样达到Ong/mL。那么目前的各种检测体系都将不能达到这个要求，因此需要一种检测灵敏度更高测定方法。免疫磁珠(Immunomagnctic beads, 1MB)是免疫学和磁载体技术相结合而发 展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗 原的靶物质特异性地结合形成新的复合物，通过外加磁场的作用，使磁球和上清 快速分离，可以在短时间内得到浓縮、纯净的待测样品，縮短检测时间，提高检 测效益和灵敏度。目前，MB-ELISA检测方法是免疫磁珠在免疫检测领域最主要 的应用，其釆用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物 的分离和蛋白质、DNA、 RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测，其基本步骤为 一、用抗原和磁珠进行偶联，制备免疫磁珠。二、将检测样品和第一种抗体(简 称一抗)按一定比例混合，然后在其中加入适量体积的第一步制备出的免疫磁珠， 使免疫磁珠上的抗原和样品中的抗原竞争结合一抗，然后通过磁性分离，除去上 清。三、加入一定体积的过氧化物酶标记过的二抗，然后放在37。C条件下温育1 小时，再通过磁性分离，除去上清。四、加底物显色15分钟，把显色液移入96 孔ELISA反应板中，放入酶标仪中读数。这种方法对大分子抗原具有良好的检测效果，但是对有关氯霉素等小分子的 检测实例尚未见报道。经过实验表明，用MB-ELISA检测方法检测灵敏度要比一 般的直接竞争抑制ELISA方法高，但是检测的重复性不好，稳定性差，并不适用 于检测氯霉素等小分子。
技术实现思路
针对上述现状，本专利技术的目的在于提供一种与常规酶联免疫检测方法相比， 检测CAP样品灵敏度更高，并且重复性好，检测数据的稳定性高的氯霉素检测方 法。为实现上述目的，本专利技术所釆用的技术方案是 一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系，其特征在于，制备特异性强的抗-CAP单克隆抗体，然后将其与磁珠偶联进一步制备出包被有抗-CAP单克隆抗体的免疫磁珠；利用制备出的免疫磁珠吸附待检CAP样品中的CAP分子，再通过磁性分离技术去除上清，然后用挥发 性有机溶剂抽提免疫磁珠中吸附的CAP分子，并将其配备成浓縮的CAP样品，最 后用直接竞争抑制ELISA方法对浓縮的CAP样品进行检测得出结果。该方法利用磁性分离技术将低于常规检测法检测范围的低浓度待检CAP样品中CAP分子富集后再配备成高浓度的CAP样品。然后再用直接竞争ELISA检测 方法对其进行检测，有效的提高了对CAP含量的检测灵敏度，并且检测效益非常 好。这比直接采用直接竞争抑制ELISA方法所能检测样品浓度的最低极限 0. lng/mL高50倍左右。采用本专利技术的方法检测样品中CAP含量的具体歩骤包括第一步，免疫磁珠的制备将准备好的抗-CAP单克隆抗体和xMag异硫氰酸根末端磁珠，经过磁珠活化 —抗体偶联一磁珠洗涤一磁珠封闭一磁珠保存等步骤制备出包被有特异性强的 抗-CAP单克隆抗体的免疫磁珠；第二步，免疫磁珠吸附样品中的CAP按比例将第一步中制备的免疫磁珠加入到待检样品中，温育后利用磁性分离 技术去除上清，获得吸附有CAP分子的免疫磁珠复合物；在该步骤中，所述温育 过程适宜在37'C 180rpm的恒温摇床内进行，温育时间以40min为宜。第三步，免疫磁珠所吸附的CAP的提取利用挥发性有机溶剂对第二歩中去除上清后的免疫磁珠复合物进行CAP分 子抽提，然后将抽提液放入水浴中挥发，直到无有机溶剂气味为止；在该步骤中， 所述挥发性有机溶剂为乙酸乙酯，对免疫磁珠复合物进行CAP分子抽提的次数为 两次，每次间隔时间可为5min。第四步，用110ul的PBS溶液溶解第三歩中有机溶剂挥发后的析出物，制备 浓縮的CAP样品；第五步，用直接竞争ELISA检测方法检测第四步中得到的浓縮待检样品；第六步，根据CAP标准曲线计算出样品中的CAP含量；本专利技术的突出优点是磁性免疫载体特异性好，固液经磁力作用能较容易分 离，洗脱条件较环保无毒害作用，对于低于检测极限的氯霉素样品通过免疫磁珠 富集浓縮后检测，从而间接改变检测极限，提高检测的灵敏度，避免漏检。附图说明图1是CAP标准曲线。图2是偶联抗体的扫描曲线。图中曲线pre是偶联前抗体的检测曲线；曲线post是偶联上清的检测曲线；曲线washl是第一次洗涤液的检测曲线；曲线wash2 是第二次洗涤液的检测曲线。具体实施方式 实验(一)一、 制做CAP的ELISA标准曲线配制CAP标准品，从50ng/mL开始倍比稀释，选取浓度分别为50ng/mL、 12.5ng/mL、 3. 125ng/mL、 0.781ng/mL、 0.195ng/mL、 0. 097ng/mL、 0. 049ng/mL 的样品，设置PBS空白对照，做出标准曲线，如图1所示。二、 磁珠偶联抗-CAP单克隆抗体，制备免疫磁珠该过程参照陕西北美基因股份有限公司的xMa本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系，其特征在于，利用偶联有特异性强的抗－ＣＡＰ单克隆抗体的免疫磁珠吸附待检ＣＡＰ样品中的ＣＡＰ分子后，采用磁性分离技术去除上清，然后用挥发性有机溶剂从吸附了ＣＡＰ分子的免疫磁珠中抽提出ＣＡＰ分子，之后再将抽提出来ＣＡＰ分子配制成浓缩的ＣＡＰ样品，最后采用直接竞争抑制ＥＬＩＳＡ方法对浓缩的ＣＡＰ样品进行检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：施曼玲，陈正贤，李因来，高乃波，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]