拉米夫定用药评估试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测个体对拉米夫定药物敏感性的试剂盒。该试剂盒包括检测病人体内乙肝病毒ＤＮＡ的ＹＭＤＤ区域基因型的特异性引物对及ＤＮＡ测序引物、ＰＣＲ反应组件、ＰＣＲ产物纯化组件、ＤＮＡ测序反应组件等。通过检测病人体内乙肝病毒ＤＮＡ的ＹＭＤＤ区域基因型，来分析评估病人对拉米夫定药物的敏感性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本专利技术涉及一种检测个体对拉米夫定药物敏感性的试 剂盒。
技术介绍
乙型病毒性肝炎(简称乙型肝炎)是由乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒)引起的肝脏炎性损害，是我国 当前流行最广泛、危害最严重的一种传染病。临床表现为乏力、食欲减退、恶心、呕吐、厌油、腹泻及齒 胀，部分病例有发热、黄疸,约有半数患者起病隐匿。大部分乙型肝炎在急性期经治后能痊愈，很多病例 病程迁延或转为慢性，其中一部分可发展为肝炎后肝硬变甚至肝癌；极少数病例病程发展迅猛，肝细胞出 现大片坏死，成为重型肝炎；另有一些感染者则成为无症状的病毒携带者。乙肝病毒是己知最小的部分双链的环形DNA病毒，长3.2kb,有高度重叠的4个基因区，编码至少8 种蛋白。即S基因编码的大、中、小HBs; C基因的前C、 HBc、 HBe; P基因的聚合酶和X基因的HBx。乙 肝病毒有高复制率和高突变率，高突变是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功 能所致。乙肝病毒这种高突变性造成乙肝病毒在诊断和治疗是产生种种困难。拉米夫定(Lamivudine, LAM，商品名为贺普丁))是当前乙肝病毒治疗广泛应用的核苷类似物，它能 显著降低乙肝病毒DNA水平，并可使ALT正常化和肝组织改善。其作用机理是抑制乙肝病毒的逆转录和复 制。但在拉米夫定长期治疗中，乙肝病毒发生变异，产生耐药。其机理是拉米夫定作用位点YMDD发生突 变。YMDD变异包括第552位蛋基酸(M),被缬氨酸(V)或异亮氨酸(I)所取代，即M552V与M552I (即 rtM204VI变异)，两者可单独存在或混合存在，也可伴第528位亮氨酸(L)被蛋氨酸(M)所取代的变异， 即L528M (即rtL180M)变异。野生株YMDD部位呈缓和口袋型，有利于核苷酸和拉米夫定结合，552位点 的变异使侧链变短，柔性降低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸盐之间形成空间位阻，导致与拉米夫定 三磷酸盐的结合力下降，从而不可继续合成HBV DNA。YMDD变异后，拉米夫定结合靶点失去了 YMDD的正常基序，对该药结合的敏感性大大降低，使拉米夫 定对HBV前基因RNA逆转录及负链DNA复制为正链DNA的酶促过程不能抑制，从而造成耐药。迅速及时的 检测乙肝病毒的YMDD突变，特别是能检测少量YMDD突变，可以帮助医生及时改变用药，防止拉米呋啶出 现严重的耐药性，减少由YMDD突变株引起的症状恶化。同时，还能避免拉米夫定可能对患者造成的毒副 作用。
技术实现思路
根据国家生物基因检测技术应用评估认证中心颁布的《中国人口健康服务基因位点认证规程》，对与 拉米夫定药物敏感性相关基因位点的支持文献、分子生物学机理研究、中国人群适用性等进行综合分析评 估后，确定检测病人体内乙肝病毒DNA的YMDD区域基因型可用于评估被检者对拉米夫定药物敏感性。基于检测病人体内乙肝病毒DNA的YMDD区域基因型可用于评估被检者对拉米夫定药物敏感性的基础 上，本专利技术提供一种检测个体对拉米夫定药物敏感性的试剂盒。该试剂盒包括检测病人体内乙肝病毒DNA的YMDD区域基因型的特异性引物对及DNA测序引物； PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、反应缓冲液、去离子水等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、Exo I酶、去离子水等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去离子 水等)。本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对病人体内乙肝病毒DNA的YMDD区域基因型，能特异性扩增 出包含YMDD区域的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本试剂盒中所述的DNA测序引物是指针对病人体内乙肝病毒DNA的YMDD区域而设计，能通过DNA测 序技术特异性检测出YMDD区域基因型的DNA测序引物。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。 DNA测序引物可用常规的合成技术进行合成。本专利技术试剂盒的组分和含量包括-1. PCR反应套装10X PCR反应缓冲液2.5u1,25mM dNTP混合液0.2u1，25mM MgCh溶液1. 5u1，5units/(il T叫DNA聚合酶0. 125u1，20nM特异性引物对毎条引物各0.25h1,去离子水19. 175nl。2. PCR产物纯化套装 lunits/Vl SAP酶0.75u1， lOunits/nl Exol酶0. 375pl， 去离子水3.875nl。3. 测序反应套装 25% BigDye mix3. 2nM DNA测序引物lpl， 125mM EDTA溶液1u1， 100%乙醇溶液15nl， 70%乙醇溶液30nl, HIDI溶液8u1， 去离子水2nl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC。 具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2: PCR扩增反应 使用检测试剂盒中的PCR反应套装。反应的体系为总体积25nl,包含浓度为12.5ng/nl的DNA模板lpl、10XPCR反应缓冲液2.5u1，25mM dNTP混合液0.2u1， 25mMMgC12溶液1.5u1, 5units/pl Taq DNA聚合酶0.125u1, 20nM特异性引物对每 条引物各0,25nl，去离子水19.175nl。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为94°C 、 12分钟，进行30个循环的94°C 、 30秒，60 。C、 30秒，72°C、 30秒，然后进行72。C、 IO分钟。步骤3: PCR产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化套装，反应体系为总体积25nl，包含PCR产物20jal， lunits/pl SAP 酶0.75u1, 10units/nl Exol酶0. 375|n，去离子水3.875u1。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37。C、 15分钟，72°C、 20分钟。 步骤4: DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应套装，反应的体系为总体积5pl，包含PCR纯化产物1^1,25% BigDye mix lpl， 3.2nMDNA测序引物lpl，去离子水2fi1。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98'C 、2分钟，进行25个循环的％°C 、30秒，55°C 、 30秒,60°C、 4分钟。反应结束后加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15pl，于室温下沉淀15分钟；在4°C以3650 转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30pl，以3650转/分的转速离心15分钟， 轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8pl，放入测序仪中。步骤5:基因型分析熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.对病人进行拉米夫定药物敏感性评估的服本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测个体对拉米夫定药物敏感性的试剂盒，其特征在于：包括检测病人体内乙肝病毒ＤＮＡ的ＹＭＤＤ区域基因型的特异性引物对及ＤＮＡ测序引物、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ混合液、ＭｇＣｌ↓［２］溶液、反应缓冲液、ＳＡＰ酶、Ｅｘｏ　Ｉ酶、ＢｉｇＤｙｅ　ｍｉｘ，ＥＤＴＡ溶液、７０％乙醇溶液、１００％乙醇溶液、ＨＩＤＩ溶液、去离子水等。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冯哲民，邹祖烨，
申请(专利权)人：上海主健生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]