一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法技术

一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法：将LAPS芯片、光源驱动电路、信号放大电路、和LabVIEW平台组成了LAPS实时测试系统。设计合成了AuNPs/PEI‑rGO复合材料；将AuNPs/PEI‑rGO和GPC3‑Apt修饰在LAPS芯片形成敏感单元。在敏感单元上滴加GPC3标准溶液，形成LAPS的测试基片；在外加偏置电压作用下，LAPS测试基片上GPC3与GPC3‑Apt的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，I‑V曲线产生相应的偏移；该偏移量与GPC3浓度在0.1‑100μg/mL表现出良好的线性关系，实现了对GPC3的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法。
技术介绍
Glypican-3（GPC3）即磷脂酰肌醇蛋白多糖3，检测方法主要方法有荧光免疫分析法、酶联免疫吸附法（ELISA）、电化学分析方法等。免疫学方法测定血清GPC3其检测敏感性差而难以临床转化应用。公开号为CN106645724A的专利技术专利，公开了一种循环肿瘤细胞表面标志分子GPC3的检测方法，通过对血液进行红细胞裂解，利用纳米技术使剩余有核细胞全部平铺富集在纳米基底上固定，用细胞核荧光染料DAPI标记出所有细胞，用GPC3一抗孵育所有细胞，再用标记有FITC荧光基团的二抗孵育，最后通过高通量技术扫描。公开号为CN101290318B的专利技术专利公开了一种用于诊断肝癌的ELISA试剂盒。但方法操作繁琐、复杂，费用昂贵。光寻址电位传感器（LightAddressablePotentionmetricSensor，LAPS）是一种基于场效应结构的空间分辨生化传感器，无标记的光电流大小可以检测LAPS芯片敏感单元的电位变化，在稳定性、灵敏度、响应速度等方面具有优秀的性能，是蛋白质芯片检测的新方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于光寻址电位传感器检测GPC3的方法。首先设计一种金纳米粒子/聚乙烯亚胺-还原氧化石墨烯（AuNPs/PEI-rGO）复合材料，将AuNPs/PEI-rGO复合材料和GPC3适配体（GPC3-Apt）修饰在LAPS芯片形成敏感单元，设计了一种能特异性检测血清中GPC3水平的光寻址电位传感器。该方法具有高稳定性、高灵敏度、检测时间短、所需的样品数量少等。本专利技术的检测原理：将LAPS测试基片、光源驱动电路、信号放大电路、和LabVIEW平台组成了LAPS实时测试系统。设计合成了金纳米粒子/聚乙烯亚胺-还原氧化石墨烯（AuNPs/PEI-rGO）复合材料，将AuNPs/PEI-rGO和GPC3-Apt修饰在LAPS芯片形成敏感单元。在LAPS敏感单元上滴加GPC3标准溶液，形成LAPS的测试基片。将LAP的测试基片放到LAPS测试系统，在外加偏置电压作用下，LAPS测试基片上GPC3与GPC3-Apt的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，（I-V）曲线产生相应的偏移。该偏移量与GPC3浓度在0.1-100μg/mL表现出良好的线性关系，实现对GPC3的检测。本专利技术按照以下步骤进行：步骤1：AuNPs/PEI-rGO复合材料的制备（1）首先，取氯金酸溶液放入圆底烧瓶中，搅拌直至沸腾。然后将柠檬酸钠溶液缓缓加入沸腾了的氯金酸溶中，溶液继续维持沸腾状态，搅拌后，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，最终冷却到室温；（2）以氧化石墨烯（GO）为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得还原氧化石墨烯（rGO）的稳定分散液，其次与PEI混合并回流加热。得到的黑色分散液使用超纯水洗涤，离心，在室内空气中干燥；（3）通过简单的方法合成AuNPs/PEI-rGO复合材料。将PEI-rGO和@AuNPs混合过夜。将得到的混合物离心。沉淀物最终分散在蒸馏水中。步骤2：LAPS芯片敏感单元的构建（1）首先将硅片放置在溶液（H2O2和浓H2SO4）中浸泡，然后将硅片依次置于乙醇、丙酮和纯水中，于超声清洗机中超声清洗，最后静置后用纯水清洗干净；（2）在芯片工作面滴加NaOH溶液，清洗干净，其次使得LAPS芯片表面被氨基硅烷化试剂（APTES）硅烷化，使得LAPS芯片表面含有大量的氨基（-NH2），用纯水清洗三次，得到氨基硅烷化LAPS芯片（APTES-LAPS芯片），以碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化APTES-LAPS芯片；（3）在活化的APTES-LAPS芯片表面继续滴加AuNPs/PEI-rGO溶液，在恒温孵育箱中孵育，清洗干净，提高导电性的同时可以增加GPC3-Apt的负载量，得到AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS芯片；（4）在AuNPs/PEI-rGO/APTES的基础上滴加GPC3-Apt溶液，在恒温孵育箱中孵育后用缓冲液清洗晾干备用，得到GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS敏感单元。步骤3：GPC3的工作曲线绘制（1）在GPC3-Apt/AuNPs/PEI-rGO/APTES-LAPS敏感单元滴加GPC3标准液形成LAPS的测试基片，浸入到PBS缓冲液里面，在外加偏置电压作用下，（I-V）曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；（2）根据LAPS系统的偏移电压值与GPC3浓度的关系，绘制工作曲线。并计算出该方法的最低检测限。步骤4：待测样品中GPC3的检测（1）用待测样品制备的LAPS芯片敏感单元浸入到PBS缓冲液里面，（I-V）曲线产生相应的偏移，记录LAPS系统的偏移电压值；（2）根据步骤3所得到的GPC3的工作曲线，计算待测样品中GPC3的浓度。优选步骤1中rGO溶液浓度为0.5mg/mL。优选步骤1中PEI浓度为3%。优选步骤2中H2O2和浓H2SO4体积比3:7。优选步骤2中NaOH溶液浓度为1.0mol/L。优选步骤2中EDC/NHS浓度为10mmol/L。优选步骤2中芯片的孵育温度为25°C。优选步骤3中PBS缓冲液的pH值为5.7。优选所述步骤3中的偏置电压扫描范围-2V~2V。其中，步骤1通过简单混合法合成了AuNPs/PEI-rGO纳米复合材料。AuNPs/PEI-rGO具有优异导电性和大比表面积，增加GPC3-Apt的负载量。为步骤2提供了一个良好的基础。步骤2中构建了LAPS芯片敏感单元，一种电解质/绝缘层/硅片所构建的敏感单元，利用GPC3适配体和GPC3蛋白的特异性结合以及AuNPs/PEI-rGO纳米复合材料优异导电性的性质，通过（I-V）曲线产生相应的偏移量来实现GPC3检测的目的。步骤2中LAPS芯片敏感单元的构建为步骤3和步骤4中GPC3的检测中必不可少的关键步骤。步骤3的GPC3的工作曲线为步骤4的实际样本中GPC3浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能实现GPC3的检测。本专利技术与现有技术相比具有如下优点：1.目前一般采用免疫法测定血清GPC3水平，因其检测敏感性差而难以临床转化应用，而LAPS有很多优点，例如强的光学地址指定功能、高稳定性、高的灵敏度、检测时间短、所需的样品数量少等，已经作为生物传感技术的新星在发展。2.AuNPs/PEI-rGO具有优异导电性和大比表面积，在外加偏置电压作用下，LAPS测试基片上GPC3与GPC3-Apt的特异性结合导致敏感单元表面的电势的改变，（I-V）曲线产生相应的偏移。该偏移量与GPC3浓度在0.1-100μg/mL表现出良好的线性关系，实现对GPC3的检测。3.构建基于光寻址电位传感本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种AuNPs/PEI-rGO复合材料的制备，其特征在于：包括如下步骤，/n（1）取氯金酸溶液，加热至沸腾，将柠檬酸钠溶液缓缓加入，维持沸腾状态，搅拌，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，冷却到室温；/n（2）以氧化石墨烯为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得rGO的稳定分散液；与 PEI混合并回流加热，得到黑色分散液；用超纯水洗涤，离心，在室内空气中干燥；/n（3）合成AuNPs/PEI-rGO复合材料/n将PEI-rGO和@AuNPs混合过夜，将得到的混合物离心，沉淀物最终分散在蒸馏水中。/n

【技术特征摘要】
1.一种AuNPs/PEI-rGO复合材料的制备，其特征在于：包括如下步骤，
（1）取氯金酸溶液，加热至沸腾，将柠檬酸钠溶液缓缓加入，维持沸腾状态，搅拌，溶液的颜色从无色变蓝色再变为酒红色，冷却到室温；
（2）以氧化石墨烯为原料，利用抗坏血酸为还原剂，制得rGO的稳定分散液；与PEI混合并回流加热，得到黑色分散液；用超纯水洗涤，离心，在室内空气中干燥；
（3）合成AuNPs/PEI-rGO复合材料
将PEI-rGO和@AuNPs混合过夜，将得到的混合物离心，沉淀物最终分散在蒸馏水中。


2.一种用权利要求1所述AuNPs/PEI-rGO复合材料修饰芯片检测GPC3的方法，包含以下步骤：
步骤1：LAPS芯片敏感单元的构建
（1）首先将硅片放置在由H2O2和浓H2SO4组成的溶液中浸泡，然后将硅片依次置于乙醇、丙酮和纯水中，于超声清洗机中超声清洗，最后静置后用纯水清洗干净；
（2）在干净的芯片工作面滴加NaOH溶液，清洗干净，其次使得LAPS芯片表面被APTES硅烷化，表面以-NH2基团终止，得到氨基硅烷化LAPS芯片，用纯水清洗三次，得到APTES芯片；
（3）在APTES芯片表面继续滴加AuNPs/PEI-rGO溶液，在恒温孵育箱中孵育，清洗干净，提高导电性的同时可以增加GPC3-Apt的负载量，得到AuNPs/PEI-rGO/APTES芯片；
（4）在上述芯片AuNPs/PEI-rGO/APTES的基础上滴加GPC3-Apt溶液，在恒温孵育箱中孵育后用缓冲液清洗晾干...

【专利技术属性】
技术研发人员：李桂银，周治德，赵乐，陈敏，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：广西;45