【技术实现步骤摘要】
确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法本申请是2013年8月16日提交的专利技术名称为“确定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法”的申请号为2013800456094的中国专利技术专利申请的分案申请。专利
本专利技术涉及检测含有细胞的液体样品中靶核酸存在或不存在的方法。专利技术背景为检测靶核酸存在或不存在，现有技术中已知几种方法是基于捕获包含待检测靶核酸的杂交体，在此称为杂交捕获检测(hybridcapturingassay)。各技术的基础描述于，例如WO93/10263，进一步的发展描述于WO2010/127223。各技术用于检测和表征特定的核酸序列和序列改变，例如检测指示感染的病毒或细菌核酸序列存在或不存在、疾病和癌症相关的哺乳动物基因的等位基因的变体的存在和法医样品中发现的核酸来源的鉴定，以及胎儿诊断，例如亲子鉴定。基于杂交体捕获的所述技术得到广泛应用，可用于检测DNA或RNA(反向杂交捕获)，特别是在临床诊断领域。FDA批准的检测是digeneHC2HPVDNA测定，它采用手动转换程序处理两种和LBC介质，以便后续通过digeneHC2High-RiskHPVDNA测定进行测试。相应手工方案需要耗时、手动的转换方法，包括许多重复的动作。为收集临床样品中的细胞，必须将它们离心，必须除去上清液，然后制备细胞以供随后的测定。每天处理500至2500份样本的高容量实验室由于重复的手工步骤而面临大量的人体工程学相关损伤，例如腕管综合症，该情况在较低容量的实验室中也有较低程度的存在。因此，本领域非常需要能避免手...
【技术保护点】
1.一种测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：/na)将含有阴离子交换部分的表面与样品在适合于诱导所述细胞和所述表面之间结合的条件下接触；/nb)将含有结合细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；/nc)从细胞释放核酸；/nd)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；和/ne)检测所述杂交体的存在或不存在。/n
【技术特征摘要】
20120830 EP 12182339.7;20120830 US 61/695,0421.一种测定细胞样品中靶核酸存在或不存在的方法，所述方法包括：
a)将含有阴离子交换部分的表面与样品在适合于诱导所述细胞和所述表面之间结合的条件下接触；
b)将含有结合细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；
c)从细胞释放核酸；
d)在靶核酸和靶核酸的特异性探针之间形成杂交体；和
e)检测所述杂交体的存在或不存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤d)之前不分离含有阴离子交换部分的表面。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，含有阴离子交换部分的表面具有至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或所有的以下特征：
i.所述阴离子交换部分包含胺基；
ii.所述表面包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分；
iii.所述阴离子交换部分耐受步骤d)中所用条件下的降解；
iv.所述表面由颗粒提供；
v.所述表面由磁性颗粒提供；
vi.所述表面由平均尺寸为5μm或更低、3μm或更低、2μm或更低和1.5μm或更低的颗粒提供；和/或
vii.所述表面由在颗粒表面包含羧基的磁性颗粒提供，其中至少一部分所述羧基用聚乙烯亚胺官能化以提供阴离子交换部分。
4.如权利要求1-3中一个或多个所述的方法，其特征在于，在细胞样品中，细胞包含在液体介质，优选液基细胞学介质中。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包含阴离子交换部分的表面由磁性颗粒提供，其中在所述磁性颗粒与样品接触后，所述磁性颗粒在得到的混合物中的浓度选自：50μg/ml-2000μg/ml、75μg/ml-1750μg/ml、100μg/ml-1500μg/ml、125μg/ml-1250μg/ml和150μg/ml-1100μg/ml。
6.如权利要求1-5中一个或多个所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，细胞结合发生在选自3-8.5、3.5-8.0、3.5-7.75、3.5-7.5、3.5-7.25或3.75–7的pH范围的pH值下。
7.如权利要求1-6中一个或多个所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从所述细胞释放的液体组合物接触，其中，任选地，在步骤c)中进行加热步骤以促进核酸的释放和/或变性。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述液体组合物具有一种或多种，优选至少两种、至少三种和更优选所有的以下特征i到v：
i.它包含一离液剂；
ii.它具有碱性pH值；
iii.它具有的pH值选自：pH12或更高、pH12.5或更高、pH13或更高、或pH13.25或更高；
iv.它包含一种或多种添加剂，优选
aa)螯合剂；
bb)缓冲剂；和/或
cc)防腐剂
v.所述液体组合物通过混合两种或多种组合物获得，其中所述组合物之一包含离液剂，和所述组合物之一是包含碱性试剂的碱性溶液。
9.如权利要求1-8中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换表面由包含聚乙烯亚胺作为阴离子交换部分的磁性颗粒提供，其中，所述磁性颗粒不在步骤c)和d)之间除去。
10.如权利要求1-9中一个或多个所述的方法，其特征在于，进行杂交体捕获测定，其中步骤d)和e)包括以下步骤：
步骤d)
-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中，优选形成RNA/DNA杂交体；
-利用结合双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；
-任选地将所述双链核酸杂交体与未结合的核酸分离；
步骤e)
-检测双链核酸杂交体的存在或不存在，藉此表明所述靶核酸的存在或不存在。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述表面由磁性颗粒提供，其中所述磁性颗粒存在于所述杂交体的生产和捕获期间并且不在步骤d)中借助磁体除去，而是在进行检测步骤e)之前、在分离剩余样品和/或进行一个或多个洗涤步骤时除去。
12.如权利要求1-11中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤d)和e)
步骤d)
-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；
-捕获所述双链核酸杂交体；
-将所述双链核酸杂交体与未结合的核酸分离，从而也除去至少一部分所述磁性颗粒；
步骤e)
-检测双链核酸杂交体的存在或不存在。
13.如权利要求1-12中一个或多个所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤d)和e)
步骤d)：
-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸以及用于结合细胞的磁性颗粒的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触；
-利用结合该双链核酸杂交体的第一结合剂捕获所述双链核酸杂交体，藉此形成双链核酸杂交体/第一结合剂复合物；
-将该双链核酸杂交体/第一结合剂复合物与未结合的核酸分离，从而也除去至少一部分所述磁性颗粒；
-将所述复合物与标记有可检测标记物的另一结合剂结合，以形成双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物；
-洗涤该双链核酸杂交体/第一结合剂/标记的结合剂复合物，其中所述洗涤除去剩余的磁性颗粒，如果仍存在的话；
步骤e)
-检测另一结合剂的标记物的存在或不存在，藉此表明靶核酸的存在或不存在。
14.如权利要求1-13中一个或多个所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中细胞结合发生在所述阴离子交换部分的阴离子交换基团带正电的pH值下，优选地，细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3-8.5、3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7；
b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；
c)从细胞释放核酸并对释放的核酸进行变性；
d)在靶核酸和该靶核酸的特异性探针之间产生杂交体，其中步骤d)包括：
-在允许探针与单链靶核酸分子进行杂交形成双链核酸杂交体的条件下，将含有释放且变性的核酸的样品与一种或多种的靶核酸特异性探针接触，其中优选形成RNA/DNA杂交体；
-利用结合该双链核酸杂交体的结合剂捕获所述双链核酸杂交体；
-任选地将所捕获的双链核酸杂交体与未结合的核酸分离；
-任选地洗涤该捕获的双链核酸杂交体；
e)检测双链核酸杂合体的存在或不存在，从而指示靶核酸的存在或不存在。
15.如权利要求1-14中一个或多个，特别是权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)在适合于诱导细胞和所述表面之间结合的条件下，将含有阴离子交换部分的表面与细胞样品接触，其中所述阴离子交换部分包含至少一种伯胺、至少一种仲胺和/或至少一种叔胺基团，其中细胞结合发生在选自以下pH范围的pH值下：3.5-8、3.75-7.75、4-7.5、4.25-7.25或4.5-7，其中所述阴离子交换部分的氨基在所述pH值下带正电，其中不对结合条件作调整；
b)将结合有细胞的表面与剩余样品分离以收集细胞；
c)将所收集的阴离子交换表面结合细胞与促进核酸从细胞释放的液体...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·斯普林格豪瑟斯，C·库普弗，P·沙茨，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE
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