用于生产法尼烯的酿酒酵母制造技术

本发明专利技术公开了一种构建β‑法尼烯生产菌的方法，包括以下步骤：构建BFS基因表达质粒，其包含2μ复制子、筛选标记和序列为SEQ ID NO:1的BFS基因；提供适合表达上述BFS基因的酿酒酵母宿主菌株；将BFS基因表达质粒转化入酿酒酵母宿主菌株中，筛选阳性克隆，得到用于发酵产生β‑法尼烯的酿酒酵母工程菌。本发明专利技术所构建β‑法尼烯生产菌通过发酵能够实现发酵液中β‑法尼烯的有效积累，双倍体酿酒酵母的β‑法尼烯产量高达0.6g/L，具有工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
用于生产法尼烯的酿酒酵母
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种高产β-法尼烯的基因工程生产菌。
技术介绍
蚜虫在受到惊吓时可从腹管中分泌出一种“报警信息素”，以使周围其他蚜虫感知并迅速逃逸，从而停止对作物的侵害。Bowers等于1972年首次分离鉴定出蚜虫报警信息素反-β-法尼烯(E-β-farnesene，简称EβF或者EBF)，EβF是一种倍半萜类物质。Francis等发现EBF是16种蚜虫报警信息素的主要或唯一成分(Bowersetal.,1972；Francisetal.,2005)。该类信息素施用于田间，可使一定范围内的蚜虫虫口密度控制在域值之内，此时虫、病害对作物的影响不大。EβF不仅存在于蚜虫报警激素中，也是许多植物次生代谢产物之一。许多植物中富含EβF成分，通过分类提纯可获得高浓度精油，如唇形科Hemizygiapetiolata植物中EβF成分含量高达70％以上(Bruceetal.,2005)；伞形科Pimpinellakhorasanica植物的茎、花和种子中EβF成分也有较高的含量(Askarietal.,2013)。除了报警活性之外，EBF还具有其它多重生物活性，例如对某些昆虫具有类似保幼激素III的功能，具有调控蚜虫后代中有翅蚜与无翅蚜比例的功能，在高剂量使用时对蚜虫有明显毒杀作用等。因此，利用天然EBF的生物学特性进行蚜虫防治，具有用量少，专属性强，对非靶标生物和环境安全等优点，引起植物保护专家和农业生产者的青睐。同时，以天然EBF为基础进行结构与改造，制成EBF类似物来开发低毒性或无毒性的新农药是农业科学领域的研究热点之一。另外，人们发现β-法尼烯除了可以应用于农药领域之外，还在化工领域和医药领域具有许多用途，比如用于合成维生素E等，具有广阔的市场价值，近年来受到了人们的广泛关注。法尼烯在植物中的含量非常低，无法以提取天然产物的方式来制备；化学合成法的成本极高，且纯度较低；因而利用微生物生产法尼烯似乎成为人们利用这一天然化合物的最佳方式。微生物发酵法最大的瓶颈在于，微生物菌体中与其生物合成相关的酶的表达水平较低。因此，构建能够高水平合成β-法尼烯的工程菌是走向工业化的关键。
技术实现思路
为了克服现有β-法尼烯生产菌株发酵水平低的缺陷，本专利技术利用基因工程技术来改造-的酿酒酵母菌株，通过弱化或抑制固醇合成途径、高效表达甲羟戊酸途径(MVA途径)和来自黄花蒿并经密码子优化后的β-法尼烯合酶(β-farnesenesynthase，BFS)基因，获得高产β-法尼烯的生产菌株。研究发现，以双倍体酿酒酵母作为宿主时所得工程菌株的β-法尼烯产量要高于单倍体酿酒酵母。因此，本专利技术的一个目的在于提供一种构建β-法尼烯生产菌的方法。本专利技术的另一目的在于提供构建的β-法尼烯生产菌用于生产β-法尼烯的应用。为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种构建β-法尼烯生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.构建BFS基因表达质粒，其包含2μ复制子、筛选标记和序列为SEQIDNO:1的BFS基因，该BFS基因是来自黄花蒿并经密码子优化后的β-法尼烯合酶基因；B.通过基因编辑技术增强酿酒酵母宿主菌株的甲羟戊酸途径、弱化/抑制固醇合成途径，得到用于表达上述BFS基因的酿酒酵母宿主菌株；C.将对步骤A中所构建的BFS基因表达质粒转化入步骤B中所述的酿酒酵母宿主菌株中，筛选阳性克隆，得到用于发酵产生β-法尼烯的酿酒酵母工程菌。优选地，步骤B中所述基因编辑技术例如是CRISPR/Cas9系统。在一种优选的实施方式中，上述步骤B中所述酿酒酵母宿主菌株是双倍体酿酒酵母或单倍体酿酒酵母。优选是双倍体酿酒酵母，更优选是双倍体酿酒酵母CCTCCM94055。上述筛选标记选自抗生素的抗性基因，用于阳性克隆菌株的筛选，包括但不限于Zeocin抗性基因BLE、潮霉素抗性基因HPH、诺尔丝菌素抗性基因NAT1、G418抗性基因KANR和营养缺陷型基因：亮氨酸缺陷型基因LEU2、组氨酸缺陷型基因HIS3、色氨酸缺陷型基因TRP1、腺嘌呤缺陷型基因ADE1、尿嘧啶缺陷型基因URA3。上述基因编辑技术例如是通过CRISPR/Cas9系统将7个DNA片段整合至酿酒酵母中，所述7个DNA片段分别是：用于替换酿酒酵母ERG9启动子从而将ERG9基因的启动子替换为受硫酸铜抑制的CTR3启动子的片段；用于整合到基因组TRP1位点从而过表达β-法尼烯前体合成的甲羟戊酸途径关键基因ERG20和截短的HMG1基因的片段；用于整合到基因组URA3位点从而过表达β-法尼烯前体合成的甲羟戊酸途径关键基因ERG13和截短的HMG1基因的片段；用于整合到基因组ADE1位点从而过表达β-法尼烯前体合成的甲羟戊酸途径关键基因IDI1和截短的HMG1基因的片段；用于整合到基因组LEU2位点从而过表达β-法尼烯前体合成的甲羟戊酸途径关键基因ERG8和ERG19基因的片段；用于整合到基因组HIS3位点从而过表达β-法尼烯前体合成的甲羟戊酸途径关键基因ERG10和ERG13基因的片段；用于整合到基因组GAL1位点从而回补HIS3缺陷型的片段。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种β-法尼烯生产菌，其通过上述的方法构建得到。根据本专利技术的第三个方面，提供了上述β-法尼烯生产菌在β-法尼烯的生产中的应用。在一种实施方式中，通过对上述β-法尼烯生产菌进行发酵来生产β-法尼烯，即通过“一步发酵法”实现β-法尼烯的从头合成。其中，发酵时所用的培养基可以是任何适用于酿酒酵母生长发酵的培养基。在一种优选的实施方式中，上述β-法尼烯生产菌进行发酵时包括种子培养阶段和菌体发酵阶段(生产发酵阶段)。这两个阶段分别使用种子培养基和生产发酵培养基，可以相同或者不相同。优选地，种子培养基是YPD培养基，菌体发酵培养基是YPD发酵培养基。YPD发酵培养基是在YPD培养基中添加了2wt％半乳糖和硫酸铜后的培养基，其中半乳糖用作诱导剂；硫酸铜用于弱化基因ERG9的表达，减少竞争支路固醇前体角鲨烯的合成。上述发酵温度可以是大约30℃左右。本专利技术所构建β-法尼烯生产菌通过发酵能够实现发酵液中β-法尼烯的有效积累，双倍体酿酒酵母的β-法尼烯产量高达0.6g/L，单倍体酿酒酵母的β-法尼烯产量高达0.4g/L，具有工业化应用前景。附图说明图1为BFS基因表达质粒pYES2-ZEO-FS的结构示意图。图2是本专利技术构建的酿酒酵母工程菌(包括双倍体酿酒酵母和单倍体酿酒酵母)的代谢途径变化示意图。以双倍体酿酒酵母CCTCCM94055、单倍体酿酒酵母CIBTS4149(交配型为MATa)、单倍体酿酒酵母CIBTS4150(交配型为alpha)作为原始菌株，进行基因工程改造，引入序列为SEQIDNO:1的基因BFS，其编码β-法尼烯合酶BFS；通过基因编辑技术(例如CRISPR/Cas9)增强甲羟戊酸合成途径、弱化/抑制固醇合成途径，从而构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建β-法尼烯生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nA.构建BFS基因表达质粒，其包含2μ复制子、筛选标记和序列为SEQ ID NO:1的BFS基因；/nB.通过基因编辑技术增强酿酒酵母宿主菌株的甲羟戊酸途径、弱化/抑制固醇合成途径，得到用于表达上述BFS基因的酿酒酵母宿主菌株；/nC.将步骤A中所构建的BFS基因表达质粒转化入步骤B中所述的酿酒酵母宿主菌株中，筛选阳性克隆，得到用于发酵产生β-法尼烯的酿酒酵母工程菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种构建β-法尼烯生产菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.构建BFS基因表达质粒，其包含2μ复制子、筛选标记和序列为SEQIDNO:1的BFS基因；
B.通过基因编辑技术增强酿酒酵母宿主菌株的甲羟戊酸途径、弱化/抑制固醇合成途径，得到用于表达上述BFS基因的酿酒酵母宿主菌株；
C.将步骤A中所构建的BFS基因表达质粒转化入步骤B中所述的酿酒酵母宿主菌株中，筛选阳性克隆，得到用于发酵产生β-法尼烯的酿酒酵母工程菌。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述酿酒酵母宿主菌株是双倍体酿酒酵母。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤A中所述筛选标记选自抗生素的抗性基因：Zeocin抗性基因BLE、潮霉素抗性基因HPH、诺尔丝菌素抗性基因NAT1、G418抗性基因KANR和营养缺陷型基因：亮氨酸缺陷型基因LEU2、组氨酸缺陷型基因HIS3、色氨酸缺陷型基因TRP1、腺嘌呤缺陷型基因ADE1、尿嘧啶缺陷型基因URA3。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术是将7个DNA片段整合至酿酒酵母中，所述7个DNA片段分别是：用于替换酿酒酵母ERG9启动子从而将ERG9基因的启动子替换为受...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱丽，蒋宇，童阳阳，许崇茂，吴宇辉，杨俊杰，杨晟，张芸，赵梦凡，盛保伟，陈正杰，
申请(专利权)人：浙江医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33