一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。本发明专利技术所述的方法是先将携带目的基因的普通或特定载体转入发根农杆菌中，再用活化的发根农杆菌菌液侵染预培养的木本植物组培苗，培养至植株长出转基因毛状根后，转至添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中诱导根生芽，再经过扩繁生根从而获得整株转基因木本植株。通过本发明专利技术的方法得到转基因植株的转化效率高，不仅充分利用了木本植物自身的细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并且成本低，该方法适用性广，可以用于各种木本植物的转基因培育，具有广阔应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法
本专利技术属于植物转基因
，具体涉及一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法。
技术介绍
利用发根农杆菌转化植物是一种传统的植物转基因方法。发根农杆菌中含Ri质粒，Ri质粒T-DNA的LB端含RolA、RolB、RolC、RolD四个生根相关基因，RB端含生长素、细胞分裂素和冠瘿碱三个合成基因。这几个与生根及激素相关基因的存在使发根农杆菌侵染植物后，植物在侵染成功部位长出不定根，该不定根具有可离体生长、生长速度快、无向地性等特性。发根农杆菌菌株对不同植物的转化能力不同。而现有发根农杆菌成功转化的植物多为草本植物，如玉米、花生、菠菜、人参、苜蓿、菊花、雪莲等，且其中很多草本植物都易由转基因根系转化为整株转基因植株。但对于木本植物来说，不仅转化效率低，且转化成功的植物种类很少，目前仅有苹果、柑橘、喜树、具芒小檗等几种木本植物转化成功，而且成功由转基因根诱导为整株的也仅有柑橘。其中主要的原因的是木本植物脱分化效率较草本植物更为低下，细胞全能性差，根向芽分化难度大。芽由顶端分生组织分化而来，而WUSCHEL1基因是顶端分生组织分化的决定性因素，它能够促进顶端分生组织的分化，进而促进芽的形成。WUSCHEL1基因也能使某些组织或器官在不添加任何外源激素的情况下诱导体细胞胚发生。虽然现有技术提到过通过注射带有目的基因的发根农杆菌的菌液的方法使已生根苗再长出新的转基因毛状根，但该专利技术中最终仍停留在获得转基因根系的阶段，并未获得整株转基因植株，而WUSCHEL1基因的特性对获得整株木本植株存在重要意义。
技术实现思路
本专利技术公开了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，本专利技术克服了传统植物转基因方法低效率、高成本的缺陷，将WUXCHEL1基因转入转基因植物中，提高了木本植物细胞全能性，促进转基因根向整株转基因植株的分化，并成功获得含有WUXCHEL1基因的整株转基因木本植株，提高了木本植物的转化效率。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含有目的基因的活化发根农杆菌菌液；(2)将木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下继代培养28-32天后，切掉愈伤团，转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下预培养4-6天，得到预培养组培苗；(3)取出所述预培养组培苗，切掉愈伤组织，切口处蘸取所述含有目的基因的活化发根农杆菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染组培苗；(4)将所述侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗的条件下培养1-2天后插到含有500mg/L特美汀的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；(5)待所述转基因根系的根长到5cm时切下，先转入根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗下培养5天后，再转入添加地塞米松或MdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培养基中培养直至生芽，得到转基因地上部分转基因芽；(6)将所述转基因芽先转入继代培养基，再转入生根培养基中培养至生根，得到整株转基因木本植株。进一步的，所述步骤(1)中表达载体包括普通表达载体和特定表达载体。进一步的，所述特定表达载体为地塞米松诱导型启动子载体PTA7002中插入CamV35S：：WUSCHEL1-CamV35S：：目的基因序列。进一步的，所述地塞米松的添加量为5-10μm/L。进一步的，所述MdWUSCHEL1蛋白质的浓度为5μM/L。进一步的，所述根芽转化预培养基为MS液体培养基中含0-1.0mg/LTDZ、0-1.0mg/LNAA、500mg/L特美汀、30g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。进一步的，所述生根培养基为20-25g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85MS液体培养基中含0-0.7mg/LIBA、0-0.1mg/LIAA、200mM/LcPTIO、20-25g/L蔗糖和8.5g/L琼脂，pH为5.80-5.85。进一步的，所述木本植株包括苹果、猕猴桃、樱桃、桃和桂花。进一步的，所述整株转基因木本植株的检测引物序列为：Forward：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG；Reward：TTACTTGTACAGCTCGTCCATG。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：本专利技术利用发根农杆菌转化效率高的优势，将促进植物芽生长的WUSCHEL1基因和目的基因一起转入木本植物的根系中，进一步利用木本植物自身的细胞全能性，将转基因根系脱分化形成整株转基因植株。本专利技术利用了传统转基因和分子机制结合的方法，该方法适用性广，可以用于各种木本植物的转基因培育，不仅很好的提高了转基因植株的转化效率，还可以促进转基因根向整株转基因植株的分化，且操作简单、成本低，在科研和实际农业种植中具有广阔的应用前景。附图说明图1为转基因载体图谱。图2为本专利技术实施例4获得的转基因苹果的转基因芽。图3为本专利技术实施例5获得的转基因猕猴桃的转基因芽。图4为本专利技术实施例6获得的转基因樱桃的转基因芽。图5为本专利技术实施例4-6中蛋白质检测结果，其中1：苹果中GFP，2：猕猴桃中GFP，3：樱桃中GFP。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均按照常规或制造厂商所建议的方法和条件；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得或使用常规方法制备。实施例1本专利技术所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，具体包括以下步骤：(1)将携带目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含目的基因的活化发根农杆菌菌液；(2)将生长状态良好的木本植物的组培苗放入继代培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养30天，得到继代组培苗；(3)将继代组培苗形态学下端的愈伤团切掉后转入生根培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下预培养5天，得到预培养组培苗；(4)用镊子取出预培养组培苗，切掉组培苗基部愈伤组织，将切口处在活化好的发根农杆菌菌液中蘸取一次，然后用无菌滤纸将切口处多余菌液吸干，得到侵染组培苗；(5)将侵染组培苗放回生根培养基中，于28℃，24h黑暗条件下共培养1-2天后，再插到加入500mg/L特美汀抗生素的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；(6)当转基因根系的根长到5cm时切下，先转到根芽转化预培养基中，于25℃，16h光照/8h黑暗的条件下培养5天，再转入加了5μM/LMdWUSCHEL1蛋白质的根芽转化预培本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n（1）将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含有目的基因的活化发根农杆菌菌液；/n（2）将木本植物组的培苗放入继代培养基中继代培养后，切掉愈伤团，转入生根培养基中预培养，得到预培养组培苗；/n（3）取出所述预培养组培苗后，切掉愈伤组织，切口处蘸取所述含有目的基因的活化发根农杆菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染组培苗；/n（4）将所述侵染组培苗放回生根培养基中共培养，再插到含有抗生素的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；/n（5）待所述转基因根系的根长到5cm时切下，先后两次转入根芽转化预培养基中培养直至生芽，得到转基因地上部分转基因芽；/n（6）将所述转基因芽先转入继代培养基，再转入生根培养基中培养至生根，得到整株转基因木本植株。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将含有目的基因的表达载体转入发根农杆菌后并活化，得到含有目的基因的活化发根农杆菌菌液；
（2）将木本植物组的培苗放入继代培养基中继代培养后，切掉愈伤团，转入生根培养基中预培养，得到预培养组培苗；
（3）取出所述预培养组培苗后，切掉愈伤组织，切口处蘸取所述含有目的基因的活化发根农杆菌菌液，然后吸干多余菌液得到侵染组培苗；
（4）将所述侵染组培苗放回生根培养基中共培养，再插到含有抗生素的MS培养基中培养，直到长出转基因毛状根，得到转基因根系；
（5）待所述转基因根系的根长到5cm时切下，先后两次转入根芽转化预培养基中培养直至生芽，得到转基因地上部分转基因芽；
（6）将所述转基因芽先转入继代培养基，再转入生根培养基中培养至生根，得到整株转基因木本植株。


2.根据权利要求1所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述步骤（1）中表达载体包括普通表达载体和特定表达载体，所述特定表达载体为地塞米松诱导型启动子载体PTA7002中插入CamV35S::WUSCHEL1-CamV35S::目的基因序列。


3.根据权利要求1所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因木本植株的方法，其特征在于，所述步骤（2）中继代培养的时间为28-32天，预培养时间为4-6天。


4.根据权利要求1所述的利用发根农杆菌转化获得整株转基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世忠，刘琳，郑成超，马晓君，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37