获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法技术

本发明专利技术提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法，属于基因工程技术领域，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。采用本发明专利技术提供的引物组合能够获得含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。

【技术实现步骤摘要】
获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法。
技术介绍
靶标基因ERG11发生碱基突变是植物病原菌对DMI杀菌剂产生抗药性的一种重要途径，对于靶标基因突变的研究中，除了筛选田间天然存在的突变株之外，紫外诱导突变是较为常用的方法，通过紫外诱导产生随机碱基突变，并结合室内杀菌剂浓度梯度的驯化，最终获得室内诱导抗药性突变株，这类研究已在禾谷镰刀菌、水稻稻曲病菌、核盘菌、小麦纹枯病菌等植物病原菌中报道。虽然紫外可诱导病原菌产生新的基因突变，但其基因突变频率相对较低，筛选抗药性突变株的周期亦相对较长，且大多数突变株的环境适合度可能下降。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合及方法，采用本专利技术提供的引物组合能够定点获得含碱基突变点的油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。本专利技术还提供了一种含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的获取方法，包括以下步骤：1)提取油菜黑胫病菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用上述技术方案所述的引物组合中的第一引物对、第二引物对和第三引物对分别进行扩增，得到1183bp、242bp和263bp的基因片段；2)将所述步骤1)得到的1183bp、242bp和263bp的基因片段经一次Gibson反应克隆至pLAU2载体中，得到重组质粒。优选的，所述步骤1)扩增的体系为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min；4℃保存。优选的，所述扩增的程序每25μL包括：基因组DNA1μL、High-Fidelity2×MasterMix12.5μL、10μM上下游引物各1μL和ddH2O9.5μL。本专利技术提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。采用本专利技术提供的引物组合能够获得含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒。附图说明图1为突变ERG11基因构建示意图及引物位置(UMY-1、PM001、PM002、PM003、PM004、UMY-2为引物；图2为利用三对引物分别扩增目的基因的三段片段，长度分别为1183bp(图中1、2)、242bp(图中3、4)和263bp(图中5、6)；图3为重组质粒结构示意图；图4为重组质粒用限制性内切酶PstI酶切验证结果电泳图，1-10为随机选取的重组质粒，均得到预期的酶切片段，长度为8679bp、2941bp、429bp，ck为重组前的空载体pLAU2为对照；图5为重组质粒测序结果(以PM5号为例)，图A所示重组质粒序列中ATC突变为GTC，图B中所示重组质粒序列中删除了TACGGA，且TGG突变为GGG；具体实施方式本专利技术提供了获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。在本专利技术中，所述油菜黑胫病菌优选为Leptosphaeriamaculans。在本专利技术中，所述第一引物对的上游引物(以下简称UMY-1-F)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，具体如下：GAAACCTAATCAATCAACATGGCTGTTCTTGCTACC；下游引物(以下简称PM002-R)的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，具体如下：GCATGATCGAGTGGACCGGGGCGTGG。在本专利技术中，所述第二引物对的上游引物(以下简称PM001-F)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，具体如下：CCACGCCCCGGTCCACTCGATCATGC；下游引物(以下简称PM004-R)的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，具体如下：CAACGCCCCCATCAATCTTCTCGTCGTCC。在本专利技术中，所述第三引物对的上游引物(以下简称PM003-F)的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，具体如下：AGAAGATTGATGGGGGCGTTGTGTCCAAGG；下游引物(以下简称UMY-2-R)的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，具体如下：gctcatagtcacatccctcactcgaccttctccctcctc。在本专利技术中，所述引物组合的引物的设计思路如下：根据ERG11基因中拟引入碱基突变点的位置，在其左右两端延伸10-20bp的范围内，设计用于引入点突变的引物，引物末端以G或C结尾，GC含量大于40％。引物PM001和PM002引入ATC至GTC碱基突变，导致异亮氨酸(I)变为缬氨酸(V)；引物PM003和PM004引入络氨酸(Y)、甘氨酸(G)缺失(TACGGA缺失)和色氨酸(W)突变为甘氨酸(G)(TGG突变为GGG)；其中引物PM001-F和PM002-R是碱基互补序列，长度均为26bp；PM003-F和PM004-R包含长度为21bp的碱基互补序列，碱基互补序列的作用是在扩增突变点碱基的同时，扩增同源片段，用于下一步目的片段重组；引物UMY-1-F和UMY-2-R分别位于目的基因的5’和3’端，并且包括可扩增与载体黏性末端两侧的同源片段，用于扩增片段与载体连接，加粗序列可根据实际使用的表达载体作相应修改。本专利技术还提供了一种含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的获取方法，包括以下步骤：1)提取油菜黑胫病菌的基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；/n所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；/n所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；/n所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。/n

【技术特征摘要】
1.获取含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对；
所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；
所述第三引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。


2.一种含油菜黑胫病菌突变ERG11基因的重组质粒的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取油菜黑胫病菌的基因组DNA，以所述基因组DNA为模板，用权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永青，李子钦，宋培玲，郝丽芬，燕孟娇，皇甫海燕，张福金，张欣昕，皇甫九茹，赵丽丽，贾晓清，郭晨，张英，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15