一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用，属于基因工程技术领域；所述基因PpHSP21及其编码蛋白的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过构建基因PpHSP21的植物超表达载体和沉默载体，将其利用农杆菌介导的遗传转化方法导入植株中，显示在植物中超表达PpHSP21，可显著提高植物的抗黑斑病的能力。本发明专利技术所述基因PpHSP21的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。

【技术实现步骤摘要】
一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用。
技术介绍
梨是世界上产量最高的水果之一，起源于中国西部和西南部的山区。随着全球气候变暖，极端气候事件的频繁发生导致梨越来越受到生物和非生物胁迫的影响。其中，黑斑病是影响其生长、发育、产量和果实品质的主要生物胁迫之一。叶片发病，病斑初期呈米粒大小的黑色斑点，而后病斑面积不断扩大，呈圆形或近圆形，病斑颜色逐渐加深，呈灰黑色至黑褐色。果实发病，果实表面有圆形或椭圆形斑点，病斑的颜色通常为黑色或深棕色，果实表面略微凹陷，病果腐烂严重，容易掉落。枝条发病，枝条表面会形成椭圆形或不规则的明显凹陷，并且在病健交界处经常会出现裂纹，尖端容易断裂或死亡，因此黑斑病严重影响梨果实产量和品质。砂梨是种植广泛品种，对黑斑病具有较强抗性，是研究木本植物抗病性及克隆有关抗病基因的理想材料。因此，克隆砂梨中与抗病相关基因是抗病基因工程的关键和基础。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其应用，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了所述基因PpHSP21的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，所述编码蛋白包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。本专利技术提供了一种扩增上述基因PpHSP21的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种表达上述基因PpHSP21的超表达载体，所述超表达载体以pCAMIBA1300为基础载体，将所述基因PpHSP21插入到所述基础载体的XbalI和BamHI多克隆位点之间。本专利技术还提供了上述基因PpHSP21或上述超表达载体在植物抗黑斑病遗传改良中的应用。所述植物包括梨或拟南芥。本专利技术还提供了一种提高植物黑斑病抗性的方法，在植物的基因组中超表达基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21及其编码蛋白，且基因序列如SEQIDNO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。利用qRT-PCR技术分析在黑斑病病原处理下植株所述基因PpHSP21的时间表达模式，结果表明所述基因PpHSP21受黑斑病诱导，且随处理时间延长，所述基因PpHSP21的表达量也逐渐增加，3d表达量达到峰值，随后缓慢降低，说明基因PpHSP21对于黑斑病胁迫有十分强烈的响应，表明PpHSP21是一个潜在的抗黑斑病基因。通过构建基因PpHSP21的植物超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将基因PpHSP21导入植株中，使梨抗黑斑病基因PpHSP21在植物中超表达(流程如图1所示)，可显著提高植物的抗黑斑病的能力。本专利技术所述基因PpHSP21的发现及鉴定，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。附图说明图1为本专利技术的技术流程图；图2为不同黑斑病菌株生长状况；图3为不同黑斑病菌株致病性强弱；图4为筛选部分湖熟基地的抗病感病品种；图5为308份梨品种抗黑斑病评价结果；图6为所述基因PpHSP21相应黑斑病时间表达模式示意图；其中，图6A是PpHSP21在黑斑病胁迫下的相对表达，图6B是PpHSP21在抗病和感病品种中黑斑病胁迫下的相对表达；图7为转PpHSP21拟南芥阳性鉴定及PpHSP21基因的沉默效果；图8为转PpHSP21拟南芥离体叶片接种黑斑病菌株发病症状及叶绿素含量分析；其中A是21天苗龄的拟南芥叶片在黑斑病处理4天后的表型；B和C分别是21天苗龄的拟南芥叶片在黑斑病处理4天后的叶绿素提取及叶绿素测定；D是60天大的杜梨叶片在黑斑病处理5天后的表型；E和F分别是60天苗龄的杜梨叶片在黑斑病处理5天后的叶绿素提取及叶绿素测定；图9为超表达PpHSP21的拟南芥叶片和沉默PpHSP21的杜梨叶片接种黑斑病H2O2含量测定(A和C)及H2O2的DAB染色实验结果(B和D)。具体实施方式本专利技术提供了一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述基因PpHSP21为对黑斑病响应强烈的热激蛋白编码基因。专利技术提供了所述基因PpHSP21的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术所述编码蛋白优选包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。本专利技术提供了一种扩增上述基因PpHSP21的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如PpHSP21-F1(SEQIDNO.3)所示：ATGGCTTCAACATTGGCTTTGTC，所述下游引物的核苷酸序列如PpHSP21-R1(SEQIDNO.4)所示：CTGAATTGCAACGTCAATAACC。本专利技术利用上述引物对克隆所述基因PpHSP21时，优选的以砂梨cDNA为模板，利用PCR技术克隆得到上述基因PpHSP21的cDNA全长序列，PCR程序优选包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min。本专利技术还提供了一种表达PpHSP21CDS的超表达载体，所述超表达载体以pCAMIBA1300为基础载体，将所述基因PpHSP21插入到所述基础载体的XbalI和BamHI酶切位点之间。本专利技术对所述超表达载体的构建方法并没有特殊限定，利用本领域的常规载体构建方法即可。本专利技术还提供了上述基因PpHSP21或上述超表达载体在植物抗黑斑病遗传改良中的应用。本专利技术所述植物优选包括梨或拟南芥。本专利技术还提供了一种提高植物黑斑病抗性的方法，在植物的基因组中超表达基因PpHSP21，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术所述超表达优选包括：利用利用同源重组技术，将SEQIDNO.1所示的基因连接到超表达载体pCAMIBA1300，然后转化DH5α感受态细胞，涂板，摇菌，然后将菌液送生工生物公司测序，将测序结果正确的大肠杆菌，用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂(Axygen,USA)盒提取质粒，将35S::P1300-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，其特征在于，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离自砂梨的具有抗黑斑病功能的基因PpHSP21，其特征在于，所述基因PpHSP21的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述基因PpHSP21的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求2所述编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白包含226个氨基酸，等电点为9.4，分子量为24.92KDa。


4.一种扩增权利要求1所述基因PpHSP21的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张绍铃，黄小三，邢才华，乔清海，谢智华，林立锟，齐开杰，董慧珍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32