一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了分子生物学技术领域的一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，包括以下步骤：(1)、取100‑150mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的离心管内，立即加入1000μL 2×CTAB提取缓冲液和30μL2％β‑巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min；(2)、向步骤(1)离心管中加入与提取缓冲液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，充分颠倒混匀3‑5次，于4℃低温离心；(3)、收集上清800μL至新的离心管中，该果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，适用于多糖多酚类果实中RNA的提取，能有效地提高多糖多酚类果实RNA提取效率，获得高质量的RNA，为后续分子实验的顺利进行奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法。
技术介绍
从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研讨的必要条件。要进行Northern杂交剖析，纯化mRNA以用于体外翻译或树立cDNA文库，qRT-PCR及差示剖析等分子生物学研究，都须要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完全性好的RNA是顺利进行上述研究的要害所在。许多植物由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA，而阻碍了其分子生物学方面研究的进展。一般认为在这些植物组织中，或富含酚类化合物，或富含多糖，或含有某些尚无法断定的次级代谢产物，或RNase的活性较高。在完全的细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但当组织被研磨，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA活性损失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的丧失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分辨造成RNA的化学降解和酶解。对于这些植物材料，用以前惯例的RNA提取方法以及现在比较常见的TRIzol和CTAB法都难以提取出其高质量的RNA，如芒果、葡萄和无花果等果实。因此能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNase和干扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量植物RNA成败的要害。现存的RNA提取方法主要为TRIzol和CTAB法。但针对多糖多酚类果实，如葡萄、无花果、芒果等，这两种方法提取效率过低且成功后RNA浓度较低，影响下一步试验的进行。本专利技术通过对CTAB法相关步骤进行了改良和创新，能有效地提高多糖多酚类果实RNA提取效率，为后续分子实验的顺利进行奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，能有效地提高多糖多酚类果实RNA提取效率，为后续分子实验的顺利进行奠定了基础。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，包括以下步骤：(1)、取100-150mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的离心管内，立即加入1000μL2×CTAB提取缓冲液和30μL2％β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min；(2)、向步骤(1)离心管中加入与提取缓冲液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，充分颠倒混匀3-5次，于4℃低温离心；(3)、收集上清800μL至新的离心管中，加入与该上清液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，混匀3-5次，于4℃低温离心；(4)、收集上清600μL至新的离心管中，加入该上清液0.25倍体积的LiCl溶液沉淀核酸，于4℃遮光沉淀6-8h，再经10000rpm离心20min收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，随后经10000rpm离心3min后放置2min，加入40μL的DEPC水溶解沉淀，得到总RNA；(5)、在总RNA中加入10×RNase-freeDNasebuffer(RRI)5μL、RNaseInhibitor0.5μL、RNase-freeDNase2μL；(6)、补充DEPC水至500μL，加入与补DEPC水后混合液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，然后于4℃低温离心；(7)、收集上清400μL至新的离心管中，加入该上清液2倍体积的冰无水乙醇，于-20℃沉淀核酸30min，然后在4℃低温离心；(8)、收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，弃上清，重复洗涤一次，于4℃低温离心；(9)、弃残留乙醇后，风干沉淀，加入30μLDEPC-ddH2O溶解沉淀10min，得到果实组织RNA；(10)、取1-2μL果实组织RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；(11)、将提取后的果实组织RNA分装后保存于-80℃超低温冰箱，以备后用。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述2×CTAB提取缓冲液在被加入至步骤(1)离心管前于65℃的环境下预热。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述(1)在水浴时每2min对离心管进行一次颠倒混匀。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述离心管的规格为2mL。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(6)的离心过程中，离心转速为10000rpm，离心时间为10min。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述步骤(7)的离心过程中，离心转速为10000rpm，离心时间为20min。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述步骤(8)的离心过程中，离心转速为10000rpm，离心时间为3-5min。本专利技术如上所述的果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，进一步的，所述步骤(4)和步骤(8)所用乙醇为70％乙醇或75％乙醇。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术选择LiCl溶液沉淀，在遮光条件下可以最大限度使RNA沉淀；使用冰无水乙醇代替醋酸钠沉淀RNA，效率显著提升；对一些试剂的浓度以及反应时间的调整，整体提升了多糖多酚类果实的RNA提取效率；该果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，适用于多糖多酚类果实中RNA的提取，能有效地提高多糖多酚类果实RNA提取效率，获得高质量的RNA，为后续分子实验的顺利进行奠定了基础。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为传统的CTAB法、TRIzol法和实施例1改进CTAB法提取无花果果实的RNA电泳图；具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，包括以下步骤：(1)、取100mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的2mL离心管内，立即加入1000μL65℃预热的2×CTAB提取缓冲液和30μL2％β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min，每2min对离心管进行一次颠倒混匀；(2)、向本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)、取100-150mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的离心管内，立即加入1000μL2×CTAB提取缓冲液和30μL 2％β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min；/n(2)、向步骤(1)离心管中加入与提取缓冲液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，充分颠倒混匀3-5次，于4℃低温离心；/n(3)、收集上清800μL至新的离心管中，加入与该上清液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，混匀3-5次，于4℃低温离心；/n(4)、收集上清600μL至新的离心管中，加入该上清液0.25倍体积的LiCl溶液沉淀核酸，于4℃遮光沉淀6-8h，再经10000rpm离心20min收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，随后经10000rpm离心3min后放置2min，加入40μL的DEPC水溶解沉淀，得到总RNA；/n(5)、在总RNA中加入10×RNase-free DNasebuffer(RRI)5μL、RNase Inhibitor 0.5μL、RNase-free DNase 2μL；/n(6)、补充DEPC水至500μL，加入与补DEPC水后混合液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，然后于4℃低温离心；/n(7)、收集上清400μL至新的离心管中，加入该上清液2倍体积的冰无水乙醇，于-20℃沉淀核酸30min，然后在4℃低温离心；/n(8)、收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，弃上清，重复洗涤一次，于4℃低温离心；/n(9)、弃残留乙醇后，风干沉淀，加入30μL DEPC-ddH...

【技术特征摘要】
1.一种果树中高糖多酚类果实组织RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、取100-150mg粉末状的果实样品至液氮提前预冷的离心管内，立即加入1000μL2×CTAB提取缓冲液和30μL2％β-巯基乙醇，涡旋震荡混匀，65℃水浴10min；
(2)、向步骤(1)离心管中加入与提取缓冲液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，充分颠倒混匀3-5次，于4℃低温离心；
(3)、收集上清800μL至新的离心管中，加入与该上清液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，混匀3-5次，于4℃低温离心；
(4)、收集上清600μL至新的离心管中，加入该上清液0.25倍体积的LiCl溶液沉淀核酸，于4℃遮光沉淀6-8h，再经10000rpm离心20min收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，随后经10000rpm离心3min后放置2min，加入40μL的DEPC水溶解沉淀，得到总RNA；
(5)、在总RNA中加入10×RNase-freeDNasebuffer(RRI)5μL、RNaseInhibitor0.5μL、RNase-freeDNase2μL；
(6)、补充DEPC水至500μL，加入与补DEPC水后混合液等体积、体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，冰浴10min，然后于4℃低温离心；
(7)、收集上清400μL至新的离心管中，加入该上清液2倍体积的冰无水乙醇，于-20℃沉淀核酸30min，然后在4℃低温离心；
(8)、收集沉淀，弃去上清，用乙醇洗涤沉淀，弃上清，重复洗涤一次，于4℃低温离心；
(9)、弃残留乙醇后，风干沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：王梓然，赵凯，彭磊，吕俊恒，邓明华，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：云南;53