一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法技术

本发明专利技术公开一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，属于生物医疗技术领域，通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，证实本发明专利技术所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法
本专利技术涉及生物医疗
，尤其涉及一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法。
技术介绍
帕金森(Parkinson’sdisease,PD)是一种常见的神经退行性疾病，其以黑质中多巴胺能神经元(dopaminergicneurons)的消失及路易小体的积聚为主要医学特征，以肌强直、动作迟缓、运动障碍、静止性震颤、睡眠行为异常等为临床表现。在我国，65岁以上中老年帕金森患病率为1.7％，随着老龄化现象逐年加重，帕金森患者的诊断与治疗应引起巨大关注。目前，帕金森的主要治疗方案为促多巴胺释放和缓解运动功能，通过药物治疗可在一定程度上缓解症状，但长期服用产生药物耐受，药物效果逐渐失效；同时随着病情进一步进展，药物剂量逐渐增加，出现严重的药物副作用。因此，开发新型安全有效的帕金森治疗方法是急需解决的重要问题。干细胞治疗在神经退行性疾病上具有广大应用前景，先前大量动物实验，证实干细胞及诱导的多巴胺能神经元等在阿尔茨海默症及帕金森的治疗中均显示出一定的治疗效果。其中，帕金森由于患者黑质等分泌多巴胺的神经元衰老或凋亡，使神经系统中多巴胺分泌减少或无法正常分泌多巴胺，导致帕金森病的发生。临床上的治疗方案一个是药物治疗，患者通过摄入多巴胺替代品缓解临床表现，而这种方法疗效有限，随病情进展，药物效果减弱或失效，且随着用药剂量的加大，副作用明显加大，导致人体不能耐受，病人疾病治疗失效；另一种治疗方法是脑深部电极刺激(DBS)，俗称脑起搏器，在深部电极的刺激下，促使黑质细胞产生多巴胺，然而这种DBS刺激方案因个体差异而不同，选择这种治疗方式时病人筛选具有严格的适应症，控制器的调试较复杂，易导致细胞开关反应过激出现副作用，且病情变化时固定参数不能适应病人病情的变化的需要，有时治疗效果有限，另外DBS应用一段时间后效果逐渐减弱或消失，同时得不到有效治疗。目前，国内外研究通过使用胎脑神经干细胞、胚胎神经干细胞、iPSCs细胞等进行移植来治疗帕金森病，虽得到一定的初步结果，但由于伦理问题难以通过，利用基因编辑技术等获得的诱导性细胞具有致瘤性，且此方法存在技术复杂、成本过高、实验不易控制，批次间纯度不一等问题，众议较多，限制了以上干细胞方法的应用，难以进一步发展。
技术实现思路
本专利技术提供一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞后，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够实现脂肪干细胞培养及转化，能够稳定分离、扩增脂肪干细胞，且能高效的实现脂肪干细胞转化为能够分泌多巴胺的多巴胺能神经元，可以广泛应用于老年痴呆症的治疗。本专利技术提供的具体技术方案如下：本专利技术提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法包括：采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x105～2.5x105/cm2，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1～2ml胰蛋白酶替代物消化2～3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部脱落；将脱落形成的细胞悬液吸入15ml离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2ml培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中；在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待细胞均匀分布之后放入37℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使脂肪干细胞发生传代；将发生传代反应到第三至第五代的脂肪干细胞放置在明胶包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/mlSHH、100ng/mlFGF8、50ng/mlbFGF和100g/mlL-谷氨酰胺的诱导培养基继续进行诱导分化培养；诱导分化培养至第八天时，采用生理盐水进行清洗之后将生长培养基替换为DMEM低糖、50ng/mlBDNF、100g/mlL-谷氨酰胺的转化培养基，并将细胞温育培养4天，诱导分化后得到多巴胺能神经元。可选的，所述采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗之前，所述方法还包括：提取1～2ml的自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，检测合格之后采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗。本专利技术的有益效果如下：本专利技术实施例提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，采用本专利技术的方法在原代细胞培养第5天，原代神经细胞生存率约为82％，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，本专利技术实施例的方法培养过程中原代细胞初期存活率高，证实本专利技术所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用，而且，本专利技术的方法获得的多巴胺能神经元大量分泌多巴胺，表示转化步骤具有效率高、批次间差异小。具体实施方式下面将对本专利技术实施例的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法进行详细的说明。脂肪干细胞是存在于人体脂肪组织中，具有多能分化能力的细胞，大量实验证实，在一定诱导环境中，脂肪细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：/n采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；/n采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；/n采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；/n振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；/n之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；/n之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x10...

【技术特征摘要】
1.一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；
采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；
采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；
振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；
之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；
之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x105～2.5x105/cm2，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；
当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐子卓，宫岩，陈坤，王卓凡，姜辉，
申请(专利权)人：青岛赛珥生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37