rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5‑1中编码转录调控因子RcsB的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔrcsB接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达116.48mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5‑1的2.28倍。

【技术实现步骤摘要】
rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用
本专利技术涉及rcsB基因缺失的重组粘质沙雷氏菌及其应用，属于生物

技术介绍
灵菌红素(Prodigiosin，PG)是一种具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构类物质，可由沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、河氏菌属(Hahella)、弧菌属(Vibrio)和海洋新细菌(Zooshikellarubidus)等合成。灵菌红素能在铜离子的配合下破坏细胞的双链DNA，而癌细胞内的铜离子浓度远高于普通细胞(癌细胞内的铜离子浓度一般为普通细胞的3.5倍)；灵菌红素在pH为6.8的条件下表现出最有效的DNA破坏作用，而癌细胞相比起普通细胞具有更接近6.8的pH(普通细胞的pH在7.4左右，癌细胞的pH在6.8左右)；此外，灵菌红素还能促进细胞集结，阻止癌细胞对周遭组织的入侵或是远端转移。因此，灵菌红素能有效对抗一系列的癌细胞，例如肺，结肠，肾和乳房的癌细胞系。灵菌红素的抗癌活性使得其在医药领域具有极高的应用前景。目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Lee等人通过将ZooshikellaganghwensisKCTC12044T接种至Marinebroth2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达15.40mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptionalproductionofbothprodigiosinandcycloprodigiosinasmajormetabolicconstituentsbyanovelmarinebacterium,ZooshikellarubidusS1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967–4973.)；Lee等人通过将HahellachejuensisKCTC2396T接种至Marinebroth2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28.10mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,etal.(2011).Exceptionalproductionofbothprodigiosinandcycloprodigiosinasmajormetabolicconstituentsbyanovelmarinebacterium,ZooshikellarubidusS1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967–4973.1)。因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)为宿主敲除编码转录调控因子RcsB的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述转录调控因子RcsB的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码转录调控因子RcsB的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。本专利技术还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。本专利技术还提供了上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。[有益效果]本专利技术提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5-1中编码转录调控因子RcsB的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达116.48mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的2.28倍。附图说明图1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB的PCR验证结果；其中，M为DNAMarker(2000bp)，1为以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板的PCR结果，2为以粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB基因组为模板的PCR结果。图2：粘质沙雷氏菌JNB5-1和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔrcsB发酵生产灵菌红素的产量。具体实施方式下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)S17-1购自唯地生物公司；下述实施例中涉及的pUTmini质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)JNB5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L。LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。牛膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L。下述实施例中涉及的检测方法如下：灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(pH3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后3000r·min-1离心10min，取上清；测定上清的A535的值，根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子RcsB的基因。/n

【技术特征摘要】
1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)为宿主敲除编码转录调控因子RcsB的基因。


2.如权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述转录调控因子RcsB的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.如权利要求1或2所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述编码转录调控因子RcsB的基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。


4.如权利要求1-3任一所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。


5.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，潘学玮，杨套伟，尤甲甲，易敢峰，付维来，徐美娟，张显，邵明龙，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32