一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白及获取方法技术

一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白，其氨基酸序列为：HMVDNKFNKEIVNAITEIHHLPNLNLEQRWAFIFSLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKSGGGGSGGGGIGVDNKFNKEWQNAHNEIIWLPNLNWEQKWAFINSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAASDYKDDDDKLEHHHHHH。该蛋白具有特异性强、亲和力高、热稳定性强、酸碱耐受能力强等特征，可以应用在别藻蓝蛋白的检测和纯化等领域。此外，本发明专利技术还涉及用于编码上述人工结合蛋白的DNA片段及该人工结合蛋白的获取方法。本发明专利技术通过选取高稳定性的、高可溶性的蛋白A二聚体作为骨架蛋白，在其基础上，经过基因工程改造、构建突变体库、亲和筛选等过程，最终获得的一类具有抗原结合活性的蛋白质。

【技术实现步骤摘要】
一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白及获取方法
本专利技术涉及人工结合蛋白
，尤其是一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白及获取方法。
技术介绍
藻胆蛋白是存在于蓝藻(Cyanophyceae)、红藻(Phodophyceae)、隐藻(Cryptophyceae)和少数甲藻(Pyrrophyceae)中的一种重要的捕光色素蛋白。据文献记载，藻胆蛋白一般分为三类：藻蓝蛋白(Phycocyanin，简称PC，最大吸收峰为620nm，呈湛蓝色)、藻红蛋白(Phycoerythrin，简称PE，最大吸收峰为562nm，呈紫红色)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，简称APC，最大吸收峰为652nm，呈天蓝色)。这些蛋白不仅可以作为天然色素，应用于食品、化妆品和染料等领域，而且因其还具有特定的生物活性，对癌症、糖尿病、心血管疾病以及炎症等多种疾病具有特殊疗效，因而在医疗、保健和饲料行业也具有很大的应用前景。别藻蓝蛋白位于藻胆体的中心位置，它的基本结构单位是α亚基和β亚基，以及连接它们的一段多肽，通常以(αβ)3或(αβ)6的聚合体形式存在。在别藻蓝蛋白的检测和纯化过程中，通常需要用到能够特异性识别别藻蓝蛋白的抗体。但是由于别藻蓝蛋白与藻蓝蛋白结构非常相似，而且在抗原制备纯化过程中很难完全分开，因此用传统的抗原免疫动物，从而制备的多克隆抗血清或杂交瘤单克隆抗体，很难获得较高的特异性。目前商业化的别藻蓝蛋白抗体特异性都不高，与藻蓝蛋白或多或少具有一定的交叉反应。另外，抗体分子本身具有分子量大、对酸碱以及温度的耐受能力较差，因此大大限制了它在抗原分子的检测和纯化中的应用。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种能够特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白，该蛋白具有特异性强、亲和力高、热稳定性强、酸碱耐受能力强等特征，可以应用在别藻蓝蛋白的检测和纯化等领域。此外，本专利技术还涉及用于编码上述人工结合蛋白的DNA片段及该人工结合蛋白的获取方法。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白，该人工结合蛋白的氨基酸序列为：HMVDNKFNKEIVNAITEIHHLPNLNLEQRWAFIFSLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKSGGGGSGGGGIGVDNKFNKEWQNAHNEIIWLPNLNWEQKWAFINSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAASDYKDDDDKLEHHHHHH。另一方面，本专利技术还提供一种用于编码能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白的DNA片段，该DNA片段的序列为：CATATGGTAGACAACAAATTCAACAAAGAAATCGTTAACGCGATCACTGAGATCCATCATTTACCTAACTTAAACCTGGAACAACGTTGGGCCTTCATCTTCAGTTTATTCGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAATCTGGTGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGTGGAATTGGCGTGGACAATAAATTTAACAAGGAGTGGCAGAACGCTCATAACGAAATCATCTGGCTGCCGAACCTGAACTGGGAACAGAAATGGGCGTTCATTAACTCTCTGTACGACGACCCGTCGCAGTCTGCCAACCTGCTGGCTGAAGCCAAGAAACTGAACGATGCGCAGGCCCCGAAAGCGGCCGCAAGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。再一方面，本专利技术还提供了一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白的获取方法，该方法包括如下步骤：S1:噬菌体展示蛋白A二聚体突变体库的噬菌体制备，以获得表达在噬菌体表面的蛋白A二聚体突变体库；S2:用纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白对蛋白A二聚体突变体库进行筛选；S3:用ELISA方法鉴定可特异性识别别藻蓝蛋白的阳性克隆噬菌体；S4:对上述步骤S3获得的阳性克隆噬菌体进行蛋白表达和纯化，得到阳性克隆蛋白集合；S5:将步骤S4得到的阳性克隆蛋白集合中的各蛋白，分别进行其与别藻蓝蛋白结合的特异性和亲和力检测，剔除并非APC特异性结合的蛋白；S6:对步骤S5保留的蛋白，进行热稳定性和/或酸碱耐受度检测和分析，保留热稳定性和/或耐酸碱性能最优的蛋白，为筛选的目标蛋白。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S1的方法为：S11:在2×YT-A培养基中加入蛋白A二聚体突变体大肠杆菌库，使细胞密度达到OD600nm＝0.05，在37±0.5℃振荡培养直至细胞密度达到OD600nm＝0.6，得到大肠杆菌液；S12:在大肠杆菌液中加入1012个辅助噬菌体M13K07，在30±0.5℃下振荡培养25-35分钟；S13:加入卡那霉素至终浓度为50±2mg/L，在30±0.5℃下振荡培养30分钟；S14:离心分离沉淀，重悬于2×YT-AK培养基中，在30±0.5℃下振荡培养15-20小时；S15:离心分离沉淀并丢弃，上清用0.45微米孔径的滤膜过滤后，加入1/4体积PEG/NaCl溶液，混匀并冰浴50-70分钟，以沉淀噬菌体；S16:离心收集沉淀，将噬菌体重悬于预冷的PBS缓冲液中，在冰上保持26-34分钟后离心分层，得上清液；S17:向上清液加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，并冰浴30分钟再次沉淀噬菌体；S18：离心沉淀，再次将噬菌体重悬于预冷的PBS缓冲液中，在冰上保持26-33分钟并离心分层，得上清液；S19:上清液与PBS-B以1:1混合，置于旋转混匀器上，室温下保温8-12分钟，得到噬菌体展示蛋白A二聚体突变体库，直接提供筛选。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S2的方法为：S21:将纯化的别藻蓝蛋白用PBS缓冲液稀释后，在免疫管中0-4℃包被过夜；S22:第二天弃上清后，加入PBS-B并在室温下保温80-90分钟，从而封闭免疫管内表面上的未被别藻蓝蛋白占据的结合位点；S23:将上述步骤S1制备的噬菌体悬液加到免疫管中，并在室温下保温1.5-2.5小时；S24:分别用PBST和PBS洗涤，每种洗涤至少10次，以除去未固定结合的噬菌体，保留与固定在免疫管上的别藻蓝蛋白结合的噬菌体；S25:用甘氨酸-盐酸在室温下保温4-8分钟，将与固定在免疫管上的别藻蓝蛋白结合的噬菌体洗脱下来，并加入1M的Tris溶液进行中和；S26:将洗脱下来的噬菌体悬液与细胞密度OD600nm＝0.6的大肠杆菌XL1blue培养物混合，并在37±0.5℃静置培养25-35分钟；S27:将这些细胞悬浊液铺到2×YT-A固体培养基平皿上，经3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白，其特征在于，该人工结合蛋白的氨基酸序列为：/nHMVDNKFNKEIVNAITEIHHLPNLNLEQRWAFIFSLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKSGGGGSGGGGIGVDNKFNKEWQNAHNEIIWLPNLNWEQKWAFINSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAASDYKDDDDKLEHHHHHH。/n

【技术特征摘要】
1.一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白，其特征在于，该人工结合蛋白的氨基酸序列为：
HMVDNKFNKEIVNAITEIHHLPNLNLEQRWAFIFSLFDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKSGGGGSGGGGIGVDNKFNKEWQNAHNEIIWLPNLNWEQKWAFINSLYDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAAASDYKDDDDKLEHHHHHH。


2.一种用于编码能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白的DNA片段，其特征在于，该DNA片段的序列为：
CATATGGTAGACAACAAATTCAACAAAGAAATCGTTAACGCGATCACTGAGATCCATCATTTACCTAACTTAAACCTGGAACAACGTTGGGCCTTCATCTTCAGTTTATTCGATGACCCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAGGCGCCGAAATCTGGTGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGTGGAATTGGCGTGGACAATAAATTTAACAAGGAGTGGCAGAACGCTCATAACGAAATCATCTGGCTGCCGAACCTGAACTGGGAACAGAAATGGGCGTTCATTAACTCTCTGTACGACGACCCGTCGCAGTCTGCCAACCTGCTGGCTGAAGCCAAGAAACTGAACGATGCGCAGGCCCCGAAAGCGGCCGCAAGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。


3.一种能特异性识别别藻蓝蛋白的人工结合蛋白的获取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:噬菌体展示蛋白A二聚体突变体库的噬菌体制备，以获得表达在噬菌体表面的蛋白A二聚体突变体库；
S2:用纯化的螺旋藻别藻蓝蛋白对蛋白A二聚体突变体库进行筛选；
S3:用ELISA方法鉴定可特异性识别别藻蓝蛋白的阳性克隆噬菌体；
S4:对上述步骤S3获得的阳性克隆噬菌体进行蛋白表达和纯化，得到阳性克隆蛋白集合；
S5:将步骤S4得到的阳性克隆蛋白集合中的各蛋白，分别进行其与别藻蓝蛋白结合的特异性和亲和力检测，剔除并非别藻蓝蛋白特异性结合的蛋白；
S6:对步骤S5保留的蛋白，进行热稳定性和/或酸碱耐受度检测和分析，保留热稳定性和/或耐酸碱性能最优的蛋白，为筛选的目标蛋白。


4.根据权利要求3所述的获取方法，其特征在于，步骤S1的方法为：
S11:在2×YT-A培养基中加入蛋白A二聚体突变体大肠杆菌库，使细胞密度达到OD600nm＝0.05，在37±0.5℃振荡培养直至细胞密度达到OD600nm＝0.6，得到大肠杆菌液；
S12:在大肠杆菌液中加入1012个辅助噬菌体M13K07，在30±0.5℃下振荡培养25-35分钟；
S13:加入卡那霉素至终浓度为50±2mg/L，在30±0.5℃下振荡培养30分钟；
S14:离心分离沉淀，重悬于2×YT-AK培养基中，在30±0.5℃下振荡培养15-20小时；
S15:离心分离沉淀并丢弃，上清用0.45微米孔径的滤膜过滤后，加入1/4体积PEG/NaCl溶液，混匀并冰浴50-70分钟，以沉淀噬菌体；
S16:离心收集沉淀，将噬菌体重悬于预冷的PBS缓冲液中，在冰上保持26-34分钟后离心分层，得上清液；
S17:向上清液加入1/4体积的PEG/NaCl溶液，并冰浴30分钟再次沉淀噬菌体；
S18：离心沉淀，再次将噬菌体重悬于预冷的PBS缓冲液中，在冰上保持26-33分钟并离心分层，得上清液；
S19:上清液与PBS-B以1:1混合，置于旋转混匀器上，室温下保温8-12分钟，得到噬菌体展示蛋白A二聚体突变体库，直接提供筛选。


5.根据权利要求4所述的获取方法，其特征在于，步骤S2的方法为：
S21:将纯化的别藻蓝蛋白用PBS缓冲液稀释后，在免疫管中0-4℃包被过夜；
S22:第二天弃上清后，加入PBS-B并在室温下保温80-90分钟，从而封闭免疫管内表面上的未被别藻蓝蛋白占据的结合位点；
S23:将上述步骤S1制备的噬菌体悬液加到免疫管中，并在室温下保温1.5-2.5小时；
S24:分别用PBST和PBS洗涤，每种洗涤至少10次，以除去未固定结合的噬菌体，保留与固定在免疫管上的别藻蓝蛋白结合的噬菌体；
S25:用甘氨酸-盐酸在室温下保温4-8分钟，将与固定在免疫管上的别藻蓝蛋白结合的噬菌体洗脱下来，并加入1M的Tris溶液进行中和；
S26:将洗脱下来的噬菌体悬液与细胞密度OD600nm＝0.6的大肠杆菌XL1blue培养物混合，并在37±0.5℃静置培养25-35分钟；
S27:将这些细胞悬浊液铺到2×YT-A固体培养基平皿上，经37±0.5℃过夜培养平皿，并计数梯度稀释后的生长菌落；用2×YT培养基从平皿上刮下菌落，加入甘油使终浓度为20％(v/v)，分成每管1ml，保存于-20℃，得到若干管单菌落样品。


6.根据权利要求5所述的获取方法，其特征在于，步骤S3的方法为：使用singlephageELISA方法鉴定与对应靶分子的结合情况，筛选出阳性克隆噬菌体，其具体步骤为：
S31:将上述步骤S2得到的每个单菌落样品接种到加有2×YT-A培养基的96孔深孔板中，在37±0.5℃下振荡培养15-18小时,得到培养物；
S32:次日各取一定量培养物，接种到新鲜的2×YT-A培养基，在新的96孔深孔板中，在37±0.5℃下振荡培养2-3小时；
S33:每孔加入109个M13K07辅助噬菌体，在37±0.5℃下振荡培养20-40分钟；
S34:加入卡那霉素至终浓度为50mg/升，然后继续在37±0.5℃下振荡培养15-18小时；
S35:离心沉淀细菌，取上清转移到新的预先加入了等体积20％(w/v)PEG/NaCl溶液的96孔培养板...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丽，杨苗，韩丹翔，胡强，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42