基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及基于SARS‑CoV‑2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用；制备方法为：1)人工合成NTD多肽蛋白序列对应的核苷酸序列为模板，并克隆到大肠杆菌表达载体上，构建得到重组质粒；2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株；3)以获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，发酵过程中，在添加异丙基硫代半乳糖IPTG后，产生NTD多肽，并利用组氨酸标签通过亲和层析纯化得到NTD多肽；本发明专利技术制备的NTD多肽方便高效，发酵工艺简单、耗时短、成本低，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的20％以上。

【技术实现步骤摘要】
基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用。
技术介绍
2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是具有包膜的正链RNA病毒，属冠状病毒属(Coronavirus)；其感染引起的肺炎被世界卫生组织命名为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。SARS-CoV-2属于β属的新型冠状病毒，其颗粒多是多形性，直径约60～140nm；其基因特征与中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)和急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)有明显区别。其RNA既可像mRNA一样直接进行蛋白翻译，也可当作模板合成负义链，再经负义链复制子代RNA，具有很高的突变率。中国学者首先公开公布了SARS-CoV-2基因组序列，其基因组全长约30kb，预测的开放读码框架(ORF)达11个，可能编码已知或未知的成熟功能蛋白20余种。其基因组结构具有典型的冠状病毒基因组的结构，依次为5'-非翻译区、5'-复制酶多聚糖蛋白基因(orf1/ab)、刺突糖蛋白基因(Spike，S)、小包膜糖蛋白基因(envelope，E)、膜糖蛋白基因(membrane，M)、核衣壳蛋白基因(nucleocapsid，N)以及3’-非翻译区。SARS-CoV-2作为一个新变种，其流行规律、致病机制与病原学特征都和以往流行的冠状病毒具有差异。而SARS-CoV-2全基因组序列的破译，以及与SARS-CoV基因组表现出较高的序列同源性；又为COVID-19的诊断与相关研究提供了非常有用的基础。相关研究可通过与已有的其它冠状病毒的蛋白编码特征比较预测，为后续研究提供有力的指导。核衣壳蛋白即N蛋白，是RNA病毒的主要结构蛋白之一，与致病性密切相关。SARS-CoV-2N蛋白的功能主要与结合病毒RNA来发挥作用相关，可能参与RNA的转录及复制等，更全面的生物学功能还需深入研究。从预测的蛋白质氨基酸序列分析，其可能还具有与致病机理相关的新功能，因此在COVID-19的诊断以及疫苗研发方面具有重要意义。利用基因工程重组N蛋白可以在COVID-19诊断及疫苗上应用，但重组的完整N蛋白因和病毒源生N蛋白序列完全一致，可能存在安全风险。因此，故利用SARS-CoV-2N蛋白序列，开发具有其部分核心功能的人工重组多肽，更具安全性，也更便于生产和降低成本，以应用于COVID-19诊断及疫苗开发，以及SARS-CoV-2基因组选择性包装等。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽、编码基因、重组载体、表达方法及应用，本专利技术制备重组NTD多肽更方便高效，发酵工艺简单、耗时短、成本低，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的20％以上。为了达到上述的目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽，所述NTD多肽是如SEQIDNo.1-4中任一所示氨基酸序列的多肽。进一步的，基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽基因，其编码如SEQIDNo.1-4中任一所示氨基酸序列的NTD多肽；所述NTD多肽编码基因是如SEQIDNo.5-8中任一所示核苷酸序列的编码基因；基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽的重组载体，其包含上述编码基因。进一步的，宿主细胞包含上述重组载体，所述宿主细胞为大肠杆菌；所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS、M15、TB1、DH5α或Top10。进一步的，NTD多肽编码基因的表达方法，包括以下步骤：1)设计相应的引物，利用PCR技术，以人工合成的NTD多肽对应的基因为模板扩增，将扩增的基因片段通过酶切连接的方法，插入到表达质粒中，构建重组载体；2)将重组载体转化至大肠杆菌，获得重组基因工程菌；3)将重组基因工程菌接种于培养基中，通过添加乳糖或异丙基硫代半乳糖IPTG诱导NTD多肽的表达。进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS、M15、TB1、DH5α或Top10。进一步的，本专利技术的NTD多肽、NTD多肽编码基因或重组载体在制备用于检测SARS-CoV-2的产品中的应用。进一步的，本专利技术的NTD多肽、NTD多肽编码基因或重组载体在制备SARS-CoV-2疫苗中的应用。进一步的，重组NTD多肽可进行COVID-19的临床检测；同时也为SARS-CoV-2抗原抗体检测试剂盒、疫苗开发；以及后续的SARS-CoV-2核酸药物包装多肽等开发提供基础。进一步的，NTD多肽原核表达中的制备方法，包括以下步骤：1)诱导NTD多肽表达后，继续培养菌液，利用摇瓶法培养或发酵罐培养；同时每小时检测菌液OD600值，计算大肠杆菌密度；在OD600＝2.0以下培养；2)收集发酵液，离心、破碎菌体，利用亲和层析纯化获得重组NTD多肽。进一步的，大肠杆菌的培养基为LB或PYA8，培养温度为35℃-38℃。本专利技术的有益效果：1)本专利技术的NTD多肽保留了SARS-CoV-2核蛋白的N端结构域或其中的关键修饰位点，同时保证其在SARS-CoV-2核蛋白N端对应位置具有相似的α-螺旋、β-片层等结构，以便形成三级结构相似的多肽类似物，更具安全性；2)本专利技术制备NTD多肽的方法更方便高效，发酵工艺简单、耗时短、成本低，目的蛋白表达量达菌体总蛋白的20％以上；3)本专利技术的NTD多肽，可以应用于COVID-19诊断及疫苗，SARS-CoV-2基因组选择性包装，应用范围宽泛。附图说明图1为SARS-CoV-2核蛋白在SARS-CoV-2基因组中的定位；图2为SEQIDNo.1所示NTD多肽结构图(SEQIDNo.1为SARS-CoV-2核蛋白N端一段氨基酸序列，修饰了起始氨基酸和结尾氨基酸)；图3为SEQIDNo.2所示NTD多肽结构图(在SEQIDNo.1的基础上修饰了5处以内的氨基酸)；图4为SEQIDNo.3所示NTD多肽结构图(在SEQIDNo.1的基础上修饰了10处以内的氨基酸)；图5为SEQIDNo.4所示NTD多肽结构图(在SEQIDNo.1的基础上修饰了30处以内的氨基酸)；图6为重组SARS-CoV-2核蛋白和NTD系列多肽间接ELISA值分析；图7为本专利技术实施例中四种pET-NTD载体表达NTD系列多肽的SDS-PAGE电泳检测结果图；“Control”为带pET-28(a)空载体的对照；图8为本专利技术实施例中Western检测表达的四种NTD系列多肽的Western检测结果图；图中根据Marker对应的分子量约20kDa的条带为检测到的NTD系列多肽的条带。具体实施方式为了进一步说明本专利技术的技术效果，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽，其特征在于，所述NTD多肽是如SEQ IDNo.1-4中任一所示氨基酸序列的多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽，其特征在于，所述NTD多肽是如SEQIDNo.1-4中任一所示氨基酸序列的多肽。


2.一种基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽编码基因，其特征在于，编码如权利要求1所述的NTD多肽。


3.根据权利要求2所述的NTD多肽编码基因，其特征在于，所述NTD多肽编码基因是如SEQIDNo.5-8中任一所示核苷酸序列的编码基因。


4.一种基于SARS-CoV-2核蛋白的NTD多肽的重组载体，其包含如权利要求2所述的NTD多肽编码基因。


5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求4所述的重组载体。


6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌，优选的，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)、BLR(DE3)、BL21(DE3)pLysS、M15、TB1、DH5α或Top10。


7.一种NTD多肽编码基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦小波，高华，王庆伟，张国珍，高继海，
申请(专利权)人：秦小波，
类型：发明
国别省市：四川;51