血浆中甘草酸苷的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种血浆中甘草酸苷的检测方法，其采用超高效液相色谱‑串联质谱进行检测，包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱‑串联质谱仪中进行检测；其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。本发明专利技术方法专属性强、灵敏度高、特异性强，可以满足临床大批量样品分析要求，并且操作简单。

【技术实现步骤摘要】
血浆中甘草酸苷的检测方法
本专利技术涉及医药
，特别是涉及一种血浆中甘草酸苷的检测方法。
技术介绍
甘草酸苷是由中药甘草中提取的一个活性成分，甘草酸苷有以下作用：a.抗炎症作用；b.免疫调节作用；c.对实验性肝细胞损伤的抑制作用；d.肝细胞增殖促进作用；e.抑制病毒增殖和对病毒的灭活作用。目前，由于甘草酸苷在人体中很快就转化为其活性代谢产物甘草次酸，且由于甘草酸苷在人体内的浓度较低，检测灵敏度不高，现今还没有一种检测方法，可以直接测定原型药物。根据相关指导原则的规定：“一般推荐仅测定原形药物，因为原形药物的药时曲线比代谢产物能更灵敏地反映制剂间的差异。对于从原形药物直接代谢产生的主要代谢产物，如果同时满足以下两点，应同时予以测定：1)代谢产物主要产生于进入体循环以前，如源自首过效应或肠道内代谢等；2)代谢产物显著影响药物的安全性和有效性。以上原则适用于包括前体药物在内的所有药物。建议以原形药物评价生物等效性，代谢产物的相关数据用于进一步支持临床疗效的可比性。”因此，亟待开发一种方法，用于检测原形药甘草酸苷在人体血浆中的浓度。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种检测原形药甘草酸苷在人体血浆中浓度的方法，该方法专属性强、灵敏度高、特异性高，可以满足临床大批量样品分析要求，并且操作简单。具体技术方案如下：一种血浆中甘草酸苷的检测方法，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中进行检测；其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。在其中一些实施例中，所述流动相A为0.25～0.35v/v％甲酸的乙腈溶液，所述流动相B为0.25～0.35v/v％甲酸的水溶液。在其中一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：色谱柱：WatersACQUITYBEHC18；色谱柱规格：粒径1.7±0.2μm，直径×长度：2.1±0.2mm×100±2mm；色谱柱温度：35±2℃；流速：0.40±0.02mL/min；进样量：10±1μL；自动进样器温度：5～7℃；洗针液：强洗液：体积百分比为90±5：10的乙腈和水混合液，弱洗液：体积百分比为10±5：90的乙腈和水混合液。在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的条件为：0～1.6min，流动相A43～47％，流动相B53～57％；1.6～2.80min，流动相A43～47％→93～97％，流动相B53～57％→3～7％；2.80～3.5min，流动相A93～97％，流动相B3～7％；3.5～4.3min，流动相A93～97％→43％～47％，流动相B3～7％→53～57％。在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的条件为：0～1.6min，流动相A44～46％，流动相B54～56％；1.6～2.80min，流动相A44～46％→94～96％，流动相B54～56％→4～6％；2.80～3.5min，流动相A94～96％，流动相B4～6％；3.5～4.3min，流动相A94～96％→44％～46％，流动相B4～6％→54～56％。在其中一些实施例中，所述质谱的色谱条件包括：离子源：电喷雾离子源，负离子模式下以MRM进行扫描；喷雾电压为-4500±50V；雾化气温度为600±10℃；雾化气压力为50±5Psi；辅助加热气压力为50±5Psi；气帘气压力为30±3Psi；碰撞气压力为9±1psi；碰撞室入口电压为-10±1eV；碰撞室出口电压为-13±1eV。在其中一些实施例中，甘草酸苷选择离子对：m/z821.3→m/z351.1；依折麦布选择离子对：m/z408.2→m/z271.2。在其中一些实施例中，所述依折麦布内标工作溶液中依折麦布内标的浓度为18～22ng/mL，优选为20ng/mL。在其中一些实施例中，所述血浆样本包含抗凝剂肝素钠。在其中一些实施例中，所述甲酸水溶液中甲酸与水的体积比为0.8～1.2：1。在其中一些实施例中，所述复溶液为甲醇水溶液，所述复溶液中甲醇与水的体积比为0.8～1.2：1。在其中一些实施例中，所述萃取剂为乙酸乙酯。在其中一些实施例中，所述血浆为人的血浆。在其中一些实施例中，所述血浆样品、依折麦布内标工作溶液、甲酸水溶液和萃取剂的体积比为15：1～3：8～12：50～150。可选为15：1.5～2.5：9～11：80～120。在其中一些实施例中，所述上清液和复溶液的体积比为：5～9：2。可选为6～8：2。在其中一些实施例中，所述离心的过程为：在15700±1000g的离心力下离心8～12min。在其中一些实施例中，所述检测方法还包括如下步骤：采用内标法进行定量计算，以甘草酸苷和内标依折麦布的峰面积比值带入标准曲线方程计算血浆样品中甘草酸苷的浓度。在其中一些实施例中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：在8份空白血浆中分别添加甘草酸苷浓度依次为4ng/mL(W1)、8ng/mL(W2)、20ng/mL(W3)、40ng/mL(W4)、160ng/mL(W5)、300ng/mL(W6)、480ng/mL(W7)和600ng/mL(W8)的甘草酸苷标准溶液，所述甘草酸苷标准溶液的与空白血浆的体积比为：1：18～20，依次得到最低定量下限血浆标样1(STD1)、血浆标样2(STD2)、血浆标样3(STD3)、血浆标样4(STD4)、血浆标样5(STD5)、血浆标样6(STD6)、血浆标样7(STD7)、最高定量上限血浆标样8(STD8)；分别取上述血浆标样，加入依折麦布内标工作溶液(与空白血浆的体积比为1：7～8)。另取空白血浆2份，加入体积比为1：1的甲醇-水(与空白血浆的体积比为1：18～20)，取上述1份加入依折麦布内标工作溶液(与空白血浆的体积比为1：7～8)，作为零浓度样品(0)；另1份加入体积比为1：1的甲醇-水(与空白血浆的体积比为1：7～8)，作为双空白样品(00)；再取超纯水1份，加入体积比为1：1的甲醇-水(与超纯水的体积比为1：7～8)，作为溶剂空白样品。在上述标样或样品(已添加内标/甲醇水溶液后)中分别加入甲酸水溶液，涡旋混合均匀后，加入萃取剂，涡旋并离心，取上清液并干燥，加入复溶液复溶，涡旋(甲酸水溶液、萃取剂、复溶液、上清液的体积比与所述血浆样品前处理过程一致)，得到11份标准样品；分别取上述标准样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中，检测标准样品中的甘草酸苷和内标物依折本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆中甘草酸苷的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：/n(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；/n(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中进行检测；/n其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。/n

【技术特征摘要】
1.一种血浆中甘草酸苷的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：
(1)血浆样品预处理：取血浆样本，加入依折麦布内标工作溶液以及甲酸水溶液，混合，再加入萃取剂，离心，取上层清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；
(2)样品检测：将所述待测样品注入超高效液相色谱-串联质谱仪中进行检测；
其中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A为0.2～0.4v/v％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.2～0.4v/v％甲酸的水溶液，进行梯度洗脱。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.25～0.35v/v％甲酸的乙腈溶液，所述流动相B为0.25～0.35v/v％甲酸的水溶液。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
色谱柱：WatersACQUITYBEHC18；色谱柱规格：粒径1.7±0.2μm，直径×长度：2.1±0.2mm×100±2mm；
色谱柱温度：35±2℃；
流速：0.40±0.02mL/min；
进样量：10±1μL；
自动进样器温度：5～7℃；
洗针液：强洗液：体积百分比为90±5：10的乙腈和水混合液，弱洗液：体积百分比为10±5：90的乙腈和水混合液。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件为：
0～1.6min，流动相A43～47％，流动相B53～57％；
1.6～2.80min，流动相A43～47％→93～97％，流动相B53～57％→3～7％；
2.80～3.5min，流动相A93～97％，流动相B3～7％；
3.5～4.3min，流动相A93～97％→43％～47％，流动相B3～7％→53...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭建军，胡林，韦唯，游宇，宋天铭，张林琪，
申请(专利权)人：湖南恒兴医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43