用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成；还公开了该引物和探针的组合，所述的探针由SEQ ID No：3所示的序列组成。此外，还公开包括该引物和探针组合的检测试剂盒。本发明专利技术试纸条RPA引物和探针组合对马铃薯腐烂茎线虫的检测特异性强、灵敏度高、对设备和人员素质要求低、操作简单、检测速度快、成本低，适合口岸检疫和基层现场检测。

【技术实现步骤摘要】
用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物及其检测试剂盒
本专利技术属于线虫检测
，具体涉及一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物；还涉及含有该引物的检测试剂盒，以及它们在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。
技术介绍
马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor；别名：腐烂茎线虫、甘薯茎线虫或马铃薯茎线虫等)是一种迁移性植物内寄生线虫，该线虫主要为害植物地下部，尤其是块根、块茎或球茎等。该线虫不仅对马铃薯为害严重，而且对甘薯为害也十分严重。我国部分地区因该线虫为害造成的甘薯减产一般为10％～30％，重则达50％～60％，甚至绝产无收。此外，该线虫危害范围广，其寄主还包括胡萝卜、人参、小麦、玉米和花生等90多种植物。马铃薯腐烂茎线虫也因此成为重要的检疫性线虫，而对该线虫进行准确、快速的鉴定是对其进行有效防治和口岸检疫的基础。鉴定马铃薯腐烂茎线虫的传统方法是形态学方法，由于线虫的有效鉴别特征不多，且许多表型特征不稳定，使得此方法鉴定过程繁琐，且鉴定结果常常会带有主观性，所得结果可靠性差。随着分子生物学的发展，在分子水平上鉴定线虫因其准确性强而获得广泛的应用。其中PCR扩增技术因具有灵敏度高、特异性强、准确高效等优点而获得广泛应用，但是该技术对于仪器设备、实验环境以及操作人员的要求较高，另外还存在成本高，耗时长，难以实现现场检测等弊端，使其应用受到很大限制。恒温扩增技术的开发利用弥补了PCR技术存在的弊端，该技术在恒温下即可完成扩增，相比于PCR技术，其具有对设备仪器要求低，操作简便、检测速度快等优点。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplificationLAMP)是恒温扩增技术之一，已在马铃薯腐烂茎线虫检测上应用(CN102260746A和CN107988383A以及DingShanwen等(EurJPlantPathol，2019，153(4)：1165-1175)等，可在65℃恒温50min完成检测。但是，LAMP技术的反应体系需要6条引物，存在引物设计复杂，引物合成比较麻烦，且易出现假阳性，成本相对较高等缺点，使其应用受到限制。因此，为满足口岸检疫和现场快速检测的需要，亟待开发一种准确、快速、操作简单且对仪器设备和人员要求低的马铃薯腐烂茎线虫检测方法。重组酶聚合酶扩增技术(Recombinasepolymeraseamplification，简称RPA)仅需一对30bp～35bp的引物，在25～42℃的恒温下扩增反应5～20min，即可完成检测。其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、反应温度低、操作简便等优点，可以满足口岸检疫和现场检测等快速检测的要求。目前，RPA技术已广泛应用于人、动物或植物上病原菌的快速检测，但在植物寄生线虫检测领域应用还相对较少，如仅有对植物根结线虫和松材线虫检测的报道(DeokJeaCha等ForestPathol，2019，49(3)：e12503)，但大多是基于RPA凝胶电泳体系的检测(CN109486960A；CN108559783A；JuYuliang等EurJPlantPathol，2019，155(4)：1155-1163)。其中实时荧光RPA检测技术是使用最多、最为成熟的RPA技术之一，在马铃薯腐烂茎线虫检测上已有应用(CN110863058A)。但是因实时荧光RPA检测需要荧光检测设备，存在设备成本太高，且对人员素质要求较高等缺陷，仍然难以满足基层农户现场检测的要求。所以亟需一种对设备和人员要求更低的检测体系来满足普通农户的检测需求，试纸条RPA检测体系恰好最接近满足此种需求。基于侧流层析试纸条的重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplificationAssaycombinedwithlateralflowdipstick，简写为：LFD-RPA)，简称为试纸条RPA，其在37-42℃恒温下就可进行扩增反应，对设备的要求低，如用水浴锅即可，比较廉价，甚至可以直接用人的体温进行加热，同时通过侧流层析试纸条来读取试验结果，简单可靠，一般人员皆可，对人员的素质要求低。虽然实时荧光RPA和试纸条RPA检测体系在引物的设计原则上是相同的，但其探针的设计原则存在很大不同，这样，两种检测方法的引物并不一定相同；本专利技术人研究发现，实时荧光RPA的引物(CN110863058A)在试纸条RPA检测中无法应用，因此，还需要重新设计和开发用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA的引物。目前，尚未发现应用试纸条RPA对马铃薯腐烂茎线虫进行检测的报道。
技术实现思路
针对现有PCR、LAMP以及实时荧光RPA技术存在对设备、人员素质等要求高、难以满足现场实时检测要求等问题，本专利技术目的在于利用试纸条RPA技术对马铃薯腐烂茎线虫进行检测。该技术对设备要求简单，并且通过试纸条读取检测结果，对人员素质要求不高，能满足基层农户现场和口岸检疫等实时检测要求。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，包括一对引物；所述的引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的核苷酸序列组成；所述引物包括上游引物Dt-LFITSF2和下游引物Dt-LFITSR1：Dt-LFITSF2：5′-GCAAAAGTCGTAACAAGGTGGCTGTAGGTG-3′(SEQIDNo：1)，Dt-LFITSR1：5′-Biotin-AACAAAGCCGTTTTTCGCCCACAAATTAGC-3′(SEQIDNo：2)。其中，Biotin为在下游引物的5′端引入生物素基团。本专利技术还提供了一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物和探针的组合，包括上述一对引物和一个探针；其中所述引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQIDNo：3所示的序列组成；所述探针的序列如下：Dt-LFITSPs1：5′-FAM-TAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGC-THF-AGGCACAGGGTAGTTG-C3-Spacer-3′(SEQIDNo：3)；其中，FAM为在5′端引入荧光素基团；THF为四氢呋喃；C3-Spacer用于在3′末端引入间臂从而阻止链的延伸。本专利技术还提供了上述试纸条RPA引物在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。本专利技术还提供了上述试纸条RPA引物和探针组合在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。本专利技术还提供了一种用于马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒，所述的试剂盒包含上述试纸条RPA引物和探针；其中所述的引物所述引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：1所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQIDNo：3所示的序列组成。进一步地，上述检测试剂盒，还包括再水化缓冲液(RehydrationBuffer)、280mM醋酸镁(Magnesiumacetate)、RPA冻干酶粉和ddH2O。所述RPA冻干酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，其特征在于，包括一对引物；所述的引物由SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物，其特征在于，包括一对引物；所述的引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的核苷酸序列组成。


2.权利要求1所述的试纸条RPA引物在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。


3.一种用于检测马铃薯腐烂茎线虫的试纸条RPA引物和探针的组合，其特征在于包括一对引物和一个探针；其中所述引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQIDNo：3所示的序列组成。


4.权利要求3所述的纸条RPA引物和探针组合在检测马铃薯腐烂茎线虫上的应用。


5.一种用于马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含上述试纸条RPA引物和探针；其中所述的引物所述引物由SEQIDNo：1和SEQIDNo：1所示的核苷酸序列组成；所述的探针由SEQIDNo：3所示的序列组成。


6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括再水化缓冲液、醋酸镁、RPA冻干酶粉和ddH2O。


7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RPA冻干酶粉是重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物。


8.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉，再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物2.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高波，马娟，李秀花，李焦生，王容燕，陈书龙，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13