一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法技术

本发明专利技术属于基因功能鉴定技术领域，公开了一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8‑6.0；重悬pTRV‑KoPDS和pTRV1 2种菌液时，浓度应控制在OD

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法
本专利技术属于基因功能鉴定
，尤其涉及一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法。
技术介绍
目前，红树林分布在热带亚热带地区的海陆交界处，在生物固碳、维护生物多样性、消减风浪、保护海岸带区域生活生产安全等方面提供了价值巨大的生态服务功能(Lee，etal.2014)。然而随着人类活动的不断干扰，使世界范围内的红树林正以每年1-2％的速度减少(Duke，etal.2007)。因此，开展红树林的保育工作刻不容缓。秋茄(Kandeliaobovata)是我国东南沿海红树林的优势种，对海陆交错带高有机质、低氧以及水淹等多种复杂环境有较强的耐受性(Weng，etal.2012)。解析秋茄对潮间带的适应机制对进一步了解红树植物特殊的生理生态学特性至关重要，同时也对后期红树植物在滨海潮间带的保育工作有重要的指导意义。随着当今科研技术的发展，利用基因组学和转录组学等分子生物学的手段探索植物生理生态相关的现象和问题已成为主流趋势，其不仅能精确地揭示传统植物生理现象背后的分子机制，还能发掘重要的功能基因用于后续的应用研究(Tsai，etal.2018)。但是，对于非模式生物的红树植物而言，其均未有完善的遗传转化系统，对其功能基因的鉴定通常需要借助拟南芥(Hong，etal.2018)、水稻(Prashanth，etal.2008)等模式植物。但不同植物种类间的差异使得外源转化的结果均无法确切体现目的基因在红树植物中的生物学功能。这使得红树植物在分子水平上的研究大大落后于其他模式植物。病毒诱导的基因沉默(virus-inducedgenesilencing，VIGS)是近年来新兴的一种快速检验植物基因功能的反向遗传学技术。烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)具有寄主范围广、沉默效率高、持续时间长、引起的病毒症状轻等优点(季娜娜等，2016)。TRV属于RNA病毒，其基因组包含RNA1和RNA2两条链。RNA1编码RNA依赖型RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp)基因、运动蛋白(movementprotein，Mp)和富含半胱氨酸的蛋白质。RNA2编码衣壳蛋白(coatprotein，Cp)和克隆目标基因的酶切位点。RNA1和RNA2在介导基因沉默的过程中同时发挥作用构成双元载体(Senthil-Kumar，etal.2014)。现已有不少报道证实TRV-VIGS技术被广泛应用于多种非模式植物的基因功能研究中，例如：桃(Prunuspersica.Batschcultivar“Akatsuki”and“Manami”)果实中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD4(Bai，etal.2015)、草莓(Fragaria×ananassaDuch.)八氢番茄红素去饱和酶基因PDS(Tian，etal.2015)、苹果查尔酮异构酶基因(王丽辉，2014)、樱桃(Prunusavium)P450单加氧酶基因CYP707A(Li，etal.2015a)、荔枝(Litchichinensis)类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶基因LcUFTG(Li，etal.2015b)、辣椒(Capsicumannuum)酰基转移酶3基因AT3(Arce-Rodríguez，etal.2015)、蔊菜(Rorippaindica)1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因CLA(张怡等，2013)、茄子(Solanummelogena)甲硫氨酸亚砜还原酶基因SmMsrA(赵祯等，2015)以及甜菜(Betevulgaris)八氢番茄红素去饱和酶基因PDS(龚攀等，2015)等等。但对于红树植物而言，TRV-VIGS技术是否适用于功能基因的研究还未知晓，在红树植物中如何构建TRV-VIGS沉默体系更未见报道。VIGS的作用机制具体为：当携带植物内源基因片段的重组TRV载体侵染植物后，在RdRp作用下转录形成双链RNA(doublestrandedRNA，dsRNA)。作为植物内源基因沉默的关键诱导因子，dsRNA在RNaseIII家族特异性核酸内切酶Dicer类似物的作用下，被切割成21-24核苷酸的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。siRNA在植物细胞内进一步扩增后，以单链形式与Agronautel(AGO1)蛋白等结合，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC诱导Rnase降解目标基因，从而达到降低目标基因表达量以达到基因沉默的效果。依据该原理，通过基因重组技术将外源基因片段插入TRVRNA2载体的多克隆位点上，获得重组病毒载体。再利用该载体侵染植株，以达到沉默目的基因的效果(闵德栋等，2017)。TRV-VIGS技术在不同植物中的沉默效率存在较大差异。影响VIGS沉默效率的原因大致有以下几个方面：首先，不同的宿主与VIGS载体的选择直接影响目的基因的沉默效率。例如，在番木瓜(Caricapapaya)中无法利用TRV对目标基因进行沉默，研究表明番木瓜并非TRV的寄主，因此不能以TRV为载体在番木瓜中构建VIGS体系(刘国成，2010)。其次，接种的环境对沉默效率有一定影响。接种后的环境需要满足病毒与植物的互作，让二者协同生长。第三，不同的接种方式也是影响沉默效率的关键。VIGS接种主要有机械接种法、摩擦法、农杆菌介导法以及金属离子轰击法等，其中农杆菌介导的接种使用较广(石嵘，2017)。然而，在红树植物中，对于VIGS体系的构建条件和沉默效率皆为空白。因此，在红树植物上构建VIGS体系是对红树植物功能基因研究的重要突破。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前在红树植物中对于VIGS体系的构建条件和沉默效率皆为空白。解决以上问题及缺陷的难度为：红树植物秋茄植株富含单宁等次生代谢物，按普通模式植物所用的VIGS系统，较易引起叶片超敏反应。解决以上问题及缺陷的意义为：红树植物秋茄为非模式植物，由于无法对内源基因进行原位功能分析，只能通过外源转化来分析基因的功能，这大大限制了红树植物秋茄特殊分子机制的研究。本专利的专利技术有望在秋茄上实现内源基因的验证，为特殊功能基因的发掘和利用具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法。本专利技术是这样实现的，一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，所述鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括：配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8-6.0；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，浓度应控制在OD600＝1.0，再等量混合菌液，使得pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液各自的终浓度在OD600＝0.5；结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下3-4片叶；侵染后将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，温度不超过30℃。进一步，所述重悬缓冲液的配制包括：MES195本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，所述鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括：/n配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，再等量混合菌液；/n结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下片叶；侵染后将秋茄幼苗于温室大棚正常管理。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，所述鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括：
配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，再等量混合菌液；
结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下片叶；侵染后将秋茄幼苗于温室大棚正常管理。


2.如权利要求1所述的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，所述重悬缓冲液的配制包括：MES195.2mg；MgCl2·6H2O203mg；ddH2O定容至100ml后，加入乙酰丁香酮终浓度200μM，用1molNaOH调整pH至6.0；将重悬菌液放置28℃2-4小时后，等量混合pTRV-KoPDS和pTRV1菌液，用注射器注射入秋茄的叶片中，7天后观测光漂白现象；
配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8-6.0；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，浓度应控制在OD600＝1.0，再等量混合菌液，使得pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液各自的终浓度在OD600＝0.5；
结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下3-4片叶；侵染后将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，环境温度不超过30℃。


3.如权利要求1所述的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，所述结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，利用EASYspinPlusComplexPlantRNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser完成反转录；利用PremixExTaqTMII(TaKaRa)进行KoPDS的表达量的测定，相对表达量的计算按法。


4.如权利要求3所述的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，qPCR体系和程序参照PremixExTaqTMII中的程序进行，qPCR及内参引物序列为SEQIDNO：3和S...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘铖烺，陈建明，
申请(专利权)人：闽江学院，
类型：发明
国别省市：福建;35