一种耐盐细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及了一种耐盐细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂及其制备方法与应用。该细菌漆酶，其基因来源于热葡萄糖苷酶芽孢杆菌paragebacillus thermoglucosidasius，可以用于染料脱色，同时具有高耐盐性，可以在高盐度的恶劣调件下保持酶活性，有效促进漆酶在工业方面的深度应用。

【技术实现步骤摘要】
一种耐盐细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体的说，涉及了一种耐盐细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂及其制备方法与应用。
技术介绍
漆酶（Laccase）（EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，广泛分布于真菌、细菌、昆虫和高等植物等体内。漆酶能利用分子氧作为电子受体氧化多种类型的酚类及非酚类的化合物，将分子氧还原为水。漆酶因其既可以氧化酚类又可以氧化其它高毒性环境污染物而广泛应用于染料废水处理、生物纸浆、生物修复等方面，是一种新兴的生物修复剂。相对于植物和动物漆酶来说，微生物漆酶来源比较丰富，可分为真菌来源漆酶和细菌来源漆酶，真菌漆酶一般在常温和酸性条件下比较稳定，但是在工业中的极端环境如高温、高盐和碱性条件下很难保持活性，其应用前景受到限制。细菌漆酶因其底物范围广、pH稳定性、热稳定性，以及对碱性环境的耐受性等特点而受到关注。在实际染料废水处理、生物纸浆、生物修复等过程中，需要漆酶处于含盐环境，但是目前关于细菌漆酶的耐盐性的研究相对较少，不利于漆酶在工业上的深度应用。为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，本专利技术提供一种耐盐细菌漆酶，具有高耐盐性，促进漆酶在工业方面的深度应用。进一步，本专利技术还提供一种重组载体，其包含该耐盐细菌漆酶的核苷酸序列。进一步，本专利技术还提供一种重组菌，其包含该重组载体。进一步，本专利技术还提供一种酶制剂，其包含该耐盐细菌漆酶。进一步，本专利技术还提供一种该耐盐细菌漆酶的制备方法。进一步，本专利技术还提供一种该耐盐细菌漆酶、该酶制剂的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种耐盐细菌漆酶，所述耐盐细菌漆酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。基于上述，所述耐盐细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种重组载体，包含权利要求1中所述的核苷酸序列SEQIDNO.1。该重组载体的制备方法包括：将所述耐盐细菌漆酶的基因片段插入到表达载体中，转化后筛选，即得。一种重组菌，包含上述的重组载体。该重组菌的制备方法包括：将所述重组载体转化入宿主细胞中，培养、筛选，即得。一种所述耐盐细菌漆酶的制备方法，培养上述的重组菌，诱导表达细菌漆酶，纯化细菌漆酶，即得。一种酶制剂，包含上述的耐盐细菌漆酶。一种所述的耐盐细菌漆酶、所述的酶制剂在染料脱色方面的应用。本专利技术相对现有技术具有突出的实质性特点和显著进步，具体的说，本专利技术提供的耐盐细菌漆酶来源于paragebacillusthermoglucosidasius，它属于细菌，对paragebacillusthermoglucosidasius基因组中的漆酶基因进行克隆，并把该基因在大肠杆菌中进行表达，得到了稳定的大肠杆菌表达菌株。通过镍柱亲和层析得到了高稳定性的漆酶蛋白，该细菌漆酶具有较强的耐盐性，在12%的NaCl溶液中仍能够保持超高活力，可以在高盐度的恶劣调件下保持酶活性，便于该细菌漆酶在工业上进行深度应用。附图说明图1：实施例中耐盐细菌漆酶基因的PCR扩增电泳图，电泳条带清晰，大小为816bp。图2：实施例中异源表达亲和层析纯化SDS-PAGE图，其中，1、2：已纯化目的蛋白；3、4：缓冲液洗涤层析柱；5：诱导完成之后取样；6：加入诱导剂之前取样；M：marker。图3：实施例中耐盐细菌漆酶的温度-酶活曲线(a)和pH-相对酶活曲线(b)。图4：实施例中耐盐细菌漆酶的耐盐性能。图5：实施例中耐盐细菌漆酶对于结晶紫和刚果红的染料脱色性能。具体实施方式下面通过具体实施方式，对本专利技术的技术方案做进一步的详细描述。本实施例提供一种耐盐细菌漆酶，其基因来源于热葡萄糖苷酶芽孢杆菌paragebacillusthermoglucosidasius（保藏于德国微生物菌种保藏中心，编号DSM2542，上海佰晔生物科技中心有售），利用天根生化科技（北京）有限公司提取基因组，通过NCBI基因库查找己报道的P.thermoglucosidasius漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，并设计引物进行扩增，得到耐盐细菌漆酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。具体的，提取基因组的具体方法如下：1.取细菌培养液1-5ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，尽量吸净上清。2.向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。3.向管中加入20μlProteinaseK溶液，混匀。4.加入220μl缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5.加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。9.重复操作步骤8。10.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。通过NCBI基因库查找己报道的P.thermoglucosidasius漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本专利技术的漆酶成熟肽编码基因的扩增引物如下：上游引物F5'CCGGCATATGTTAGACATTTTTCAACAAGCG3'下游引物R5'CAAACTCGAGTTCCCCCTTCCTGCCGATAAAC3'F和R用来扩增该细菌漆酶的碱基序列，在两条引物的5'端引入限制性酶切位点NdeI和XhoI以及对应的保护碱基。扩增模板为paragebacillusthermoglucosidasius的基因组，其扩增反应体系参见表1：表1扩增反应体系PCR反应参数设定为：①95℃热启动预变性2min；②98℃变性10sec；③55℃退火15sec；④72℃延伸10sec；⑤循环②、③、④步骤31次；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐盐细菌漆酶，其特征在于：所述耐盐细菌漆酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种耐盐细菌漆酶，其特征在于：所述耐盐细菌漆酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.根据权利要求1所述的耐盐细菌漆酶，其特征在于：所述耐盐细菌漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组载体，其特征在于：包含权利要求1中所述的核苷酸序列。


4.一种重组菌，其特征在于：包含权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王喜凤，屈建航，周佳，李海峰，宋明珠，秦志磊，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南;41