一种北沙参多糖及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种北沙参多糖及其制备方法和应用,属于生物医药技术领域。所述制备方法包括北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子以及利用DEAE‑纤维素填充柱分离精制北沙参多糖等步骤。本发明专利技术获得的北沙参多糖其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及半乳糖醛酸，通过RAW264.7细胞氧化损伤模型发现所述北沙参多糖具有良好的抗氧化活性。此种方法不仅操作简单、耗时短而且成本低廉。本发明专利技术获得的精制北沙参多糖能够为进一步探索北沙参多糖的结构、活性研究和开发北沙参多糖的药用价值奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
一种北沙参多糖及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药
，特别是涉及一种北沙参多糖及其制备方法和应用。
技术介绍
沙参分为南沙参和北沙参，药典记载北沙参为常用中药，是伞形科植物珊瑚菜(GLPhnialittoralisFr.schmidtexMiq.)的干燥根。北沙参是卫生部公布的药食两用资源，被《本草纲目》列为五参之一，其性凉味甘，归肺胃经，具有清肺补阴、涵养肝阴、解郁潜阳、制火益气、清养心阴、补脾肺阴、和中降逆和安神除烦等多种功效。北沙参的化学组分，包括香豆素类、多糖类、氨基酸类、磷脂类及微量元素等，其中多糖比重最大，总糖含量达70％以上。目前为止，对于北沙参多糖的研究，主要集中于生物活性研究、提取工艺优化和含量测定方面。对其药理活性的研究也仅集中在粗多糖组分，有关北沙参总多糖的分离、纯化、结构表征及活性研究的报道较为少见。不同的提纯工艺，所获得的多糖结构不同，其药理活性也呈现出较大差异。如中国专利CN105985452A使用水提醇沉法，获得的是北沙参粗多糖，周红英等通过正交设计，使用微波辅助提取北沙参多糖，他们对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基具有明显的清除能力，多糖的结构未见详细报道；中国专利CN105859903A的提取制备工艺分为除酯，水提醇沉，除蛋白，脱色素，透析，离子交换层析柱分离以及凝胶柱除盐，其获得的北沙参多糖，其单糖组成和摩尔比为：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖＝2.05:1.00:7.06。所得北沙参多糖能够清除DPPH自由基，螯合亚铁离子，具有良好的体外抗肿瘤活性，能够抑制小鼠S180移植瘤的生长。其多糖中的蛋白含量未见报道。杜宝香等发现通过水提醇沉，Sevage法除蛋白，活性炭脱色素，DEAE纤维素DE-52柱色谱法及葡聚糖凝胶G-75(SephadexG-75)柱色谱法分离与纯化得到的北沙参多糖，相对分子量23.01kDa，由甘露糖-葡萄糖醛酸-鼠李糖-葡萄糖-半乳糖-阿拉伯糖组成，摩尔比为81.86:0.12:0.17:1259.7:0.54:0.33，对体外脾脏淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用，有较好的体外免疫活性。但获得的最终产物糖含量不高，且结构不明确。目前尚未分离纯化制得北沙参均一多糖，这不利于进行多糖结构分析，无法深入探讨其作用机制。此外，北沙参多糖的生物活性研究大多数局限于对免疫系统的调节方面。纵观目前北沙参多糖的研究现状，发现存在单个化学成分与药理活性关系研究较少、相关化合物的提取和含量测定研究不足、大部分活性作用机制以及结构尚不明确等需要解决的问题。因此，为了进一步开发北沙参多糖的药用价值，保障北沙参用药的准确性和安全性，需要对北沙参化学组分、多糖结构、药理作用及其关系进行深入系统研究，并完善质量控制体系。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种北沙参多糖及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供了一种北沙参多糖，所述北沙参多糖的分子量为15.8kDa，其单糖组成摩尔比为：葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸:阿拉伯糖:鼠李糖＝18.6:6.6:5.9:5.4:1.0，蛋白含量＜0.2％。本专利技术还提供所述的北沙参多糖的制备方法，包括以下步骤：北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子和制备精制北沙参多糖。进一步的，所述北沙参粉碎为将北沙参粉碎后过筛，筛网孔径为40-80目。进一步的，所述水提醇沉步骤为将粉碎后的北沙参进行水浴回流提取，料水比为1:20-1:100(g:mL)，回流时间为1-5h，回流温度为40-80℃，此步骤的目的为提取北沙参中的水溶性多糖。将获得的北沙参水提液使用旋转蒸发仪进行浓缩，之后在浓缩后的提取液中加入无水乙醇，最终得到的乙醇浓度范围是30-95％，静置6-24h后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀。进一步的，所述除蛋白步骤为将收集的沉淀用200mL去离子水溶解，得到溶液，加入Sevage试剂，溶液与试剂体积比为4:1-1:1，振摇30分钟后，离心，弃去下层有机试剂和蛋白层，收集上清液，再加入Sevage试剂，剩余步骤同上，此步骤重复多次，直到两层交界处无明显变形蛋白，收集上清液，得到除蛋白的北沙参多糖溶液。进一步的，所述除小分子步骤为将除蛋白的北沙参多糖溶液进行浓缩，采用透析的方式取去除小分子杂质，选用截留分子量为1000–5000Da的有机或者无机膜，放置于去离子水中透析两天，每2-6小时换水，透析后溶液稍有浑浊，离心弃去沉淀，离心转速12000r/min，离心时间10-15min，将透析后的水溶液使用旋转蒸发仪进行浓缩，于-40℃冰箱中放置过夜，进行冷冻干燥，得到北沙参粗多糖。进一步的，所述精制北沙参多糖的步骤为将北沙参多糖使用去离子水溶解，用0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于DEAE-纤维素色谱柱(2.5cm×30cm)，先以去离子水洗脱2CV，流速为10ml/min，再分别以0.4mol/LNaCl、1mol/LNaCl溶液等度洗脱2.5CV，流速为10ml/min，每分钟收集一管洗脱液。洗脱液中的糖含量采用苯酚-硫酸法检测。合并滤液，使用500-1000Da的有机或无机膜进行透析除盐，浓缩后冻干即得精制北沙参多糖。进一步的，所述Sevage试剂为三氯甲烷：水饱和正丁醇以4：1的体积比混合而成的溶液。本专利技术还提供所述北沙参多糖的应用，所述应用为北沙参多糖在制备抗肿瘤药物或抗氧化活性药物中的应用。本专利技术公开了以下技术效果：通过本专利技术方法制备得到的北沙参多糖其单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖及葡萄糖醛酸。通过RAW264.7细胞氧化损伤模型发现该北沙参多糖具有良好的抗氧化活性。本专利技术的方法不仅操作简单、耗时短并且成本低廉。本专利技术获得的精制北沙参多糖能够为进一步探索北沙参多糖的结构、活性研究和开发北沙参多糖的药用价值奠定基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例1中经DEAE-纤维素色谱柱分离后得到的GLP-1和GLP-2糖含量分布图；图2是本专利技术实施例1中制得的北沙参粗多糖的单糖组成色谱图，标准品出峰顺序为1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.氨基半乳糖；5.氨基葡萄糖；6.半乳糖；7.葡萄糖；8.甘露糖或木糖；9.果糖；10.半乳糖醛酸；11.葡萄糖醛酸；图3是本专利技术实施例1中制得的精致北沙参多糖两个组分GLP-1和GLP-2的单糖组成色谱图，标准品出峰顺序为1.岩藻糖；2.鼠李糖；3.阿拉伯糖；4.半乳糖；5.葡萄糖；6.甘露糖或木糖；7.果糖；8.半乳糖醛酸；9.葡萄糖醛酸；图4是本专利技术实施例1中GLP-2的核磁共氢谱图；图5是本专利技术实施例1中GLP-2的核磁共碳谱图；图6是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种北沙参多糖，其特征在于，所述北沙参多糖的分子量为15.8kDa，其单糖组成摩尔比为：葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸:阿拉伯糖:鼠李糖＝18.6:6.6:5.9:5.4:1.0，蛋白含量＜0.2％。/n

【技术特征摘要】
1.一种北沙参多糖，其特征在于，所述北沙参多糖的分子量为15.8kDa，其单糖组成摩尔比为：葡萄糖:半乳糖:半乳糖醛酸:阿拉伯糖:鼠李糖＝18.6:6.6:5.9:5.4:1.0，蛋白含量＜0.2％。


2.一种权利要求1所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：北沙参粉碎，水提醇沉，除蛋白，除小分子，制备精制北沙参多糖。


3.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述北沙参粉碎至40-80目。


4.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述水提醇沉步骤为将粉碎后的北沙参进行回流提取，料水比为1:50(g:mL)，之后在提取液中加入无水乙醇，最终得到的乙醇浓度范围是30-95％，静置后粗多糖沉淀析出，离心后收集沉淀。


5.根据权利要求2所述的北沙参多糖的制备方法，其特征在于，所述除蛋白步骤为将收集的沉淀用200mL去离子水溶解，得到溶液，加入Sevage试剂，溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张真庆，陈磊，陈喜华，马宇蕾，李笃信，张明锦，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32