一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用制造技术

一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，属于皮肤治疗技术领域。针对如何解决皮肤损伤的问题，本发明专利技术从原代鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经体外扩大培养，收集细胞培养液，经分离提取获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够通过NLRP3炎症小体信号通路抑制LPS诱导的HaCat细胞的炎症反应，能够加快皮肤损伤小鼠模型的创面修复、减轻炎症反应。本发明专利技术可用于制备治疗皮肤损伤修复药物或化妆品。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用
本专利技术属于皮肤治疗
，具体涉及一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用。
技术介绍
皮肤是人体第一大器官，作为人体的保护屏障，具有防护外来机械损伤、防止病原微生物和化学性物质入侵机体的重要作用。皮肤损伤有外力导致的机械损伤和病理损伤，例如：日常生活中皮肤损伤，糖尿病患者并发症导致的慢性难愈合病理损伤。研究表明，在皮肤损伤修复过程中抑制炎症是促进皮肤损伤修复愈合的关键。炎症是指先天免疫系统被激活，入侵的病原体攻击皮肤组织产生的反应。目前相关研究报道表明，在治疗皮肤损伤修复中的外泌体，主要来源于脐带、骨髓、脂肪间充质干细胞，在细胞培养过程中质量不易控制。
技术实现思路
针对如何解决皮肤损伤修复的相关问题，本专利技术提供一种快速便捷的制备鹿茸间充质干细胞外泌体的技术方法及其在皮肤损伤修复过程中的应用。具体技术方案如下：一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，所述外泌体提取自鹿茸间充质干细胞。进一步地限定，所述皮肤损伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。进一步地限定，所述鹿茸外泌体通过如下方法制备获得：1)鹿茸间充质干细胞的原代分离：将鹿茸组织经预处理后，取其间充质区，分离获得间充质干细胞；2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。进一步地限定，步骤1)所述鹿茸组织为新鲜鹿茸的组织，位于鹿茸尖部区域。进一步地限定，步骤1)所述预处理是指剥去鹿茸真皮层，将鹿茸组织经含有双抗的PBS清洗后，再用高糖培养基清洗，然后离心弃上清，得到间充质区；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，所述PBS是指磷酸盐缓冲液。进一步地限定，步骤1)所述间充质干细胞通过如下方法获得：将预处理后的间充质区切块，置于含有双抗的低糖培养基中混匀，加入PBS混匀后离心，弃上清，获取间充质干细胞团，然后经胶原酶I消化，得到间充质干细胞；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素。进一步地限定，步骤2)所述培养是指将间充质干细胞置于10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，37℃和5％CO2条件培养36h。进一步地限定，步骤2)所述分离提取是指将收集的细胞培养液离心，收取上清液后进行离心处理，获得的上清液过滤后再次离心，弃上清，向沉淀中加入PBS混匀得到悬液，将悬液离心后弃上清，加入PSB溶液后静置，然后过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。进一步地限定，所述胶原酶I用量为细胞体积的4-5倍，所述胶原酶的浓度为0.075g/mL。进一步地限定，步骤2)所述收取上清液后进行离心处理中，离心处理是指将细胞上清液经1,500×g离心15min，收取上清；再经10，000×g离心30min；所述悬液离心条件为120,000×g离心60min。进一步地限定，所述过滤均为经过0.22μm滤器进行过滤；所述静置时间为15min。有益效果鹿茸间充质区来源细胞由于具有很强的分化(成骨、软骨、脂肪)能力，因此被称为鹿茸间充质干细胞。本专利技术制备的外泌体是一种细胞旁分泌物质，通过实验证明鹿茸间充质干细胞的外泌体具有如下活性：1)抑制皮肤炎症；2)促进皮肤损伤小鼠模型创面愈合；鹿茸间充质干细胞来源的外泌体具有无成瘤性以及低免疫原性的特点，在细胞来源上，鹿茸与脐带、骨髓、脂肪组织相比，具有来源广泛，质量可控等优点，可作为干细胞治疗替代物。本研究发现在皮肤损伤修复过程中，给予鹿茸间充质干细胞来源外泌体能够快速的抑制炎症，修复皮肤组织、促进皮肤细胞增殖、高效促进皮肤损伤愈合和修复，相较于其他来源的外泌体，鹿茸间充质干细胞外泌体的细胞来源广泛、质量可控并且可体外大量收集。可用于制备改善或治疗皮肤损伤修复的化妆品及药物。附图说明图1鹿茸间充质干细胞的培养及外泌体的鉴定，其中，A：鹿茸间充质细胞经传代至P2(100倍放大图片)；鹿茸间充质干细胞传代至P5(100倍放大图片)；B：流式细胞术检测鹿茸间充质细胞表达情况；C：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成脂肪能力检测；D：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成骨能力检测，；E：鹿茸间充质干细胞体外诱导分化成软骨能力检测，control代表阴性对照组(未诱导分化)，InducedGroup代表实验组，分别经过诱导分化实验；图2外泌体提取及鉴定，A：外泌体电镜结果；B：外泌体表面标记(蛋白鉴定)，其中cell为鹿茸间充质干细胞，Exo为外泌体；C：外泌体粒径分布情况，横坐标为粒径大小；图3鹿茸间充质干细胞来源外泌体对LPS诱导的HaCat细胞炎症反应的抑制作用；其中，A：ELISA检测炎症因子TNF-α；B：ELISA检测炎症因子IL-17；C：ELISA检测炎症因子IL-18；图4鹿茸间充质干细胞来源的外泌体对LPS诱导的haCat细胞的炎症的抑制作用；其中，A：Westernblot检测炎症小体相关蛋白NLRP3(1:1000，Abcam)，IL-18(1:1000，Abcam)，pro-Caspase-1(1:1000，Abcam)，IL-1β(1:1000，Abcam)和β-actin(1:1000，Abcam)的表达情况，B为以上炎症小体蛋白水平灰度值统计分析是由使用ImageJ软件，*表示(P＜0.05)，LPS：脂多糖；DeprivedExos：不含外泌体的细胞培养液；AMSC-Exo：鹿茸间充质干细胞来源的外泌体；图5鹿茸间充质干细胞来源的外泌体对皮肤损伤小鼠模型的修复作用；其中，A：经肉眼观察在3day，14day经不同分组治疗(鹿茸间充质干细胞外泌体治疗组、PBS组及空白对照组)后各组小鼠背部伤口愈合情况；B：从形态学上计算皮肤损伤小鼠的愈合率，*代表P＜0.05。具体实施方式本专利技术所使用的试剂、试剂盒、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。本专利技术中所涉及的Westernblot等实验或检测方法如无特殊说明均为本领域常规的实验方法，或参照相应的试剂盒或产品说明书进行。其中：75％酒精溶液是指体积分数为75％的酒精溶液。10％胎牛血清是指胎牛血清在相应培养基中的体积分数为10％。高糖培养基：购买自康宁，10-017-CVR。低糖培养基：购买自GIBCO，11885-084。无外泌体胎牛血清：购买自VivaCellBiocsiencesY181113。DMEM/F12培养液:购买自康宁，10-092-CVR1％盐酸酒精：75％酒精99mL加浓盐酸1mL。5％CO2是指培养箱中CO2体积分数为5％.SPF级雄性C57BL/6J：购买自辽宁长生生物有限公司。LPS：脂多糖购买自SigmaPBS：磷酸缓冲盐本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，其特征在于，所述外泌体提取自鹿茸间充质干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种外泌体在制备修复皮肤损伤的药品或化妆品中的应用，其特征在于，所述外泌体提取自鹿茸间充质干细胞。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤损伤包括擦伤、皮肤破损、烧伤、皮肤创面感染和慢性难愈合创面损伤。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鹿茸外泌体通过如下方法制备获得：
1)鹿茸间充质干细胞的原代分离：将鹿茸组织经预处理后，取其间充质区，分离获得间充质干细胞；
2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。


4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述预处理是指剥去鹿茸真皮层，将鹿茸组织经含有双抗的PBS清洗后，再用高糖培养基清洗，然后离心弃上清，得到间充质区；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，所述PBS是指磷酸盐缓冲液。


5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)所述间充质干细胞通过如下方法获得：将预处理后的间充质区切块，置于含有双抗的低糖培养基中混匀，加入PBS混匀后离心，弃上清，获取间充质干细胞团，然后经胶原酶I消化，得到间充质干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春，张琦，孙胜楠，郭佳，彭英华，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22