一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法技术

本发明专利技术涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：（1）糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm培养10～18h；（2）按0.5%～15%接种量接到种子罐，150～400rpm，通气比0.1～1.5V/V.min，25～37℃培养5～16 h；（3）按1%～10%接种量接入发酵罐，100～1000 rpm，通气比0.2～2 V/V.min，pH 6.6～8.5，25～37℃培养20～40h；（4）OD

【技术实现步骤摘要】
一种双酶发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法
本专利技术属于微生物发酵酶制剂
，涉及一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。
技术介绍
甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，其甜度是蔗糖的200～300倍，有一定程度的薄荷醇味，后苦味较为明显，整体的甜味口感不是很好。甜叶菊中的甜菊苷成分占糖苷总量的60%～70%，是苦味的主要来源；莱鲍迪苷A约占糖苷总量的15%～20%，口感优于甜菊苷，更接近于蔗糖，同时具有更高的稳定性和安全性。目前甜菊糖微生物发酵法研究较少，植物提取分离甜菊苷和莱鲍迪苷A成本较高，甜菊糖产业发展较为缓慢。随着对甜味剂口感要求的提高，对莱鲍迪苷A等高端产品的需求越来越大。甜叶菊糖基转移酶能将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，现有的酶催化技术在催化底物过程中需添加尿苷二磷酸葡萄糖作为原料，尿苷二磷酸葡萄糖市场价格高昂，导致成本较高，工业化生产受到一定限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有莱鲍迪苷A生产成本高、酶活性低的问题，提供一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250rpm下培养10～18h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000rpm，通气比为0.2～2V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD600值达到20～100时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其浓度为0.1～1.5mmol/L；（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100：1-4：400-600：50-100混合，随后在25-40℃下反应时间24-48h即可得莱鲍迪苷A。进一步，步骤（1）中LB培养基优选温度为30～36℃，转速220～235rpm，培养时间为13～15h。进一步，步骤（2）中种子罐优选转速为220～350rpm，通气比为0.5～1V/V.min，在30～36℃温度下培养8～10h。进一步，步骤（3）中发酵罐优选转速为450～780rpm，通气比为0.5～1.5V/V.min，在30～36℃温度下，控制pH为7～8，培养25～35小时。进一步，步骤（4）中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度优选为0.5～1mmol/L。进一步，所述步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照磷酸二氢钾2～10g、磷酸氢二铵1～10g、柠檬酸0.5～9g、酵母粉2～20g、葡萄糖5～50g、微量元素母液1～20g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6.6～8.5，用去离子水定容至1000ml。进一步，所述微量元素母液制备方法如下：按照EDTA-2Na0.84g、六水氯化钴0.25g、四水氯化锰1.5g、五水硫酸铜0.22g、硼酸0.3g、钼酸铵0.182g、硫酸锌1.7g、柠檬酸铁铵13.75g、浓硫酸5滴的比例去配制，用去离子水定容至1000ml。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：1.本专利技术所述制备方法通过一次发酵获得两种粗酶液，从而减少了操作步骤；2.通过双菌发酵法得到粗酶液，酶的活性较高，可达32932.8～35178.2U/ml，生产成本低，具有重要的市场价值和应用价值。具体实施方式一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，具体实施步骤如下：实施例1（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，控制LB培养基温度为33℃，转速180rpm，培养时间18h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照2%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为180rpm，通气比（每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示，V/V.min）为0.5V/V.min，33℃温度下培养9h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照2%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为600rpm，通气比为1.5V/V.min，33℃温度下，控制pH为7.4，培养30小时，发酵结束得到发酵液；（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD600值达到40时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其含量在0.6mmol/L；（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬15min得到菌体，菌体在0.2Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；（6）催化体系：1000L反应体系，甜菊糖苷40kg，尿苷二磷酸1.5kg，磷酸缓冲液600kg，粗酶液70kg，剩下加水补充到1000L进行混合，在30℃下反应时间30h即可得莱鲍迪苷A。实验测得莱鲍迪苷A的浓度为33.5g/L。实施例2（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，控制LB培养基温度30℃，转速220rpm，培养时间16h；（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照3%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为220rpm，通气比为0.6V/V.min，30℃温度下培养10h，得到种子培养液；（3）发酵罐生产：将种子培养液按照3%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为800rpm，通气比为1.5V/V.min，30℃温度下，控制pH为7.8，培养40小时，发酵结束得到发酵液；（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD600值达到50时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其含量在0.8mmol/L；（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：/n（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250 rpm下培养10～18h；/n（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16 h，得到种子培养液；/n（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000 rpm，通气比为0.2～2 V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；/n（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD

【技术特征摘要】
1.一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因和蔗糖合酶AtSUSY基因连接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，25～37℃、200～250rpm下培养10～18h；
（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.5%～15%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为150～400rpm，通气比为0.1～1.5V/V.min，25～37℃温度下培养5～16h，得到种子培养液；
（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～10%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～1000rpm，通气比为0.2～2V/V.min，25～37℃温度下，控制pH为6.6～8.5，培养20～40小时，发酵结束得到发酵液；
（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD600值达到20～100时，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制其浓度为0.1～1.5mmol/L；
（5）将步骤（4）所得的发酵液进行压滤得到大肠杆菌菌体，进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液、压滤得到粗酶液；
（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比40-100：1-4：400-600：50-100混合，随后在25-40℃下反应时间24-48h即可得莱鲍迪苷A。


2.根据权利要求1所述一种双菌发酵催化生产莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（1）中LB...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙多龙，祁飞，孙彩军，陆晓雨，
申请(专利权)人：安徽金禾实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34