一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。所述方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与荧光蛋白mCherry融合而成。应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察到转基因棉花活体细胞中的微管蛋白在棉花生命活动过程中的动态变化，且所获得转基因棉花并不影响棉花的生长发育、棉花纤维长度及棉花产量，可作为棉花生产和研究行业的标准株系。本发明专利技术获得的转基因棉花可用于棉花生长发育、细胞分裂、细胞器运输等方面的研究，特别是可用于棉花纤维发育过程中微管动态分析，在棉花纤维品质改良的机制研究方面有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种示踪棉花细胞中微管正极端的转基因棉花标签株系的培育方法及其应用。
技术介绍
棉花(Gossypium)是世界上重要的经济作物之一，也是全球纺织工业最主要的天然纤维来源。棉花的主要产品是棉纤维，棉纤维的特性直接决定了棉花的品质。棉纤维的品质包括棉纤维长度、棉纤维细度、棉纤维强度等，这些都与棉花纤维细胞发育密切相关。棉花纤维细胞是由胚珠外珠被表皮细胞特异分化发育而成的单细胞，是研究单细胞极性生长和纤维素合成的理想材料。在植物细胞中细胞骨架有两种：微管与微丝。研究表明，微管骨架与植物细胞生长方向的决定以及纤维素合成密切相关，因此研究棉花纤维细胞中微管的结构及动态特性对于解析棉花纤维细胞生长机制以及棉花纤维遗传改良具有重要意义。微管的主要成分是微管蛋白，微管蛋白主要包括α-微管蛋白、β-微管蛋白和微管结合蛋白。在植物细胞中，微管处于不断的变化中。微管蛋白两端的亚基不断的聚合和解聚，聚合速度大于解聚速度的一端为微管的正极端。
技术实现思路
本专利技术利用荧光蛋白标记棉花细胞中正在生长的微管的正极端，获得可观察活体棉花纤维细胞生长过程中微管动态的转基因棉花。该转基因棉花所有叶表皮细胞、棉花纤维细胞等组织均有mCherry-EB1b融合蛋白的表达，且应用激光共聚焦成像系统能清晰地观察到在棉花生长发育过程中活细胞中微管的动态变化。本专利技术首先保护一种转基因棉花微管标签株系的培育方法。本专利技术保护的转基因棉花微管标签株系的培育方法包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与荧光蛋白融合而成。上述方法中，所述微管正极端结合蛋白EB1b(氨基酸序列如序列2第241-529位所示)可以结合正在生长的微管的正极端，通过将其与荧光蛋白在棉花细胞中融合表达，即可观察棉花细胞中的微管的动态变化。上述方法中，所述荧光蛋白可为现有技术中的常见荧光蛋白，在本专利技术的一个具体实施例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mCherry，所述融合蛋白由微管正极端结合蛋白EB1b与红色荧光蛋白mCherry融合而成。进一步的，所述融合蛋白为如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1、标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述d)中，“同源性”包括与本专利技术的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。更进一步的，所述融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：1)其编码序列是序列1第1370-4533位所示的DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的蛋白质的DNA分子。其中，所述DNA分子可以是cDNA分子、基因组DNA分子或重组DNA分子。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本专利技术的编码上述融合蛋白的DNA分子进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码上述融合蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本专利技术的核苷酸序列并且等同于本专利技术的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述方法中，所述融合蛋白的编码基因通过重组载体导入受体棉花中。携带有所述编码基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化受体植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。进一步的，所述重组载体为将含有融合蛋白的编码基因的DNA片段插入表达载体中得到的载体。更进一步的，所述含有融合蛋白的编码基因的DNA片段依次包括用于启动所述融合蛋白的编码基因表达的启动子、荧光蛋白mCherry编码基因和微管正极端蛋白EB1b编码基因。在本专利技术的一个具体实施例中，所述重组载体具体为pGWB1-PEB1b:mCherry-EB1b，其为用序列1所示的DNA分子替换pGWB1表达载体的attB1和attB2位点之间的DNA片段后得到的载体。上述方法中，所述受体棉花可为现有技术中常见的棉花品种，在本专利技术的一个具体实施例中，所述受体棉花为新彩棉7号。本专利技术另一方面保护按照上述方法制备得到的转基因棉花或其繁殖后代的新用途。本专利技术提供了转基因棉花或其繁殖后代在如下A1)-A5)中任一种中的应用：A1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因棉花的培育方法，包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；/n所述融合蛋白由荧光蛋白与微管正极端结合蛋白EB1b融合而成。/n

【技术特征摘要】
1.一种转基因棉花的培育方法，包括如下步骤：将融合蛋白的编码基因导入受体棉花中，得到所述转基因棉花；
所述融合蛋白由荧光蛋白与微管正极端结合蛋白EB1b融合而成。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mCherry。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白为如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1第1370-4533位所示的DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的蛋白质的DNA分子。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因通过重组载体导入受体棉花中；
或，所述重组载体为将含有融合蛋白的编码基因的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔照胜，于艳军，冯志迪，王光达，田娟，马银平，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11